八肋游仆蟲中心蛋白磷酸化及其性質(zhì)的研究.pdf

1、蛋白質(zhì)可逆磷酸化是細(xì)胞內(nèi)的一種重要的共價翻譯后修飾(PTMs)，同時也是原核生物和真核生物中一種普遍存在的調(diào)控過程，在生物體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用。此外，在生理環(huán)境中細(xì)胞外信號觸發(fā)的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化，為細(xì)胞開啟或關(guān)閉不同的生理進(jìn)程提供了特定機(jī)制。
　　本文選用八肋游仆蟲中心蛋白為對象從以下方面研究了蛋白激酶A(PKA)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)磷酸化作用。
　　首先運用分子生物學(xué)方法構(gòu)建得到了一個基因重組質(zhì)粒(pGEX

2、-6p-1-N+1-EoCen)，并誘導(dǎo)、表達(dá)、純化得到了目的蛋白N+1-EoCen;同時純化了全分子八肋游仆蟲中心蛋白(EoCen)以及其N-端和C-端兩種半分子蛋白(N-EoCen和C-EoCen)。
　　31P-NMR和native-PAGE實驗表明PKA可以催化EoCen發(fā)生磷酸化反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)稀土Tb3+對EoCen的磷酸化無明顯影響，而1倍于蛋白濃度的Ca2+對其有促進(jìn)作用，2～4倍于蛋白濃度的Ca2+對其有抑制作用;此外

3、，C-端的Ser-166(KQTS)為PKA在EoCen上的磷酸化位點。
　　Native-PAGE、CD及TNS熒光滴定實驗表明磷酸化修飾后EoCen二級結(jié)構(gòu)中部分α-螺旋結(jié)構(gòu)減旋，暴露的疏水表面有所減小，疏水表面大小順序為:磷酸化前蛋白＞磷酸化后蛋白;鋱飽和磷酸化蛋白＞鈣飽和磷酸化蛋白＞空磷酸化蛋白。
　　Native-PAGE、CD及熒光滴定實驗表明磷酸化后的C-EoCen(即P-C-EoCen)與melittin的結(jié)