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文檔簡介
1、中心蛋白(centrin)是一種分子量大約為20 kDa的中心體常駐蛋白,它與細(xì)胞內(nèi)纖維收縮、細(xì)胞分裂及紡錘體的分離等密切相關(guān)。在細(xì)胞內(nèi),蛋白質(zhì)可逆磷酸化是一種重要的共價翻譯后修飾(PTMs),為生物體內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞調(diào)節(jié)起到重要作用。因此其在機(jī)體內(nèi)的磷酸化與去磷酸化行為,為細(xì)胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了一個重要的調(diào)控機(jī)制。
每個中心蛋白分子均含有四個結(jié)構(gòu)域,每一個結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合一個金屬離子,其中Ⅰ、Ⅱ結(jié)合位點(diǎn)位于蛋白的N端結(jié)構(gòu)
2、域;Ⅲ、Ⅳ結(jié)合位點(diǎn)位于蛋白的C-端結(jié)構(gòu)域。本文選用中心蛋白C-端半分子(C-EoCen)為研究對象,著重研究了由蛋白激酶A介導(dǎo)的C-EoCen磷酸化前后同金屬離子之間的相互作用以及化學(xué)交聯(lián)的性質(zhì)。
首先運(yùn)用分子生物學(xué)方法,構(gòu)建得到了一個基因重組質(zhì)粒pGEX-6p-C-EoCen,將重組質(zhì)粒pGEX-6p-C-EoCen轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,獲得表達(dá)工程菌并挑取單菌落活化、培養(yǎng)誘導(dǎo),離心收集菌體,超聲裂解液經(jīng)GS
3、T柱親和層析、PPase酶切、濃縮處理后獲得中心蛋白C-端半分子(C-EoCen)。經(jīng)SDS-PAGE分析顯示所得蛋白不含有雜蛋白條帶,達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需純度。
運(yùn)用熒光光譜、圓二色光譜和紫外差光譜的方法研究C-EoCen與Sm3+的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)Sm3+與C-EoCen結(jié)合后,蛋白質(zhì)從關(guān)閉式構(gòu)象轉(zhuǎn)換為開放式構(gòu)象,蛋白的疏水性結(jié)構(gòu)域外露程度增強(qiáng);蛋白質(zhì)的α-螺旋含量明顯增強(qiáng);Sm3+與C-EoCen的Ⅲ、Ⅳ結(jié)合位點(diǎn)的條件穩(wěn)定常數(shù)分別
4、為:lgKⅣ=6.81±0.51,lgKⅢ=6.23±0.39。
Native-PAGE、TNS熒光實(shí)驗(yàn)表明PKA可以催化C-EoCen發(fā)生磷酸化反應(yīng);磷酸化修飾后的C-EoCen暴露的疏水面積比磷酸化前的蛋白減少,并發(fā)現(xiàn)金屬離子Ca2+、Tb3+、Gd3+對C-EoCen的磷酸化均有抑制作用,隨著金屬離子的增加抑制作用更為明顯。
利用Native-PAGE、TNS熒光實(shí)驗(yàn)表明,磷酸化前后的中心蛋白C-端半分
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