PSD-95Y523磷酸化參與NR2A酷氨酸磷酸化水平上調(diào)分子機制的研究.pdf

1、目的: PSD-95(postsynaptie density protein95)是谷氨酸能興奮性突觸傳遞中重要的腳手架蛋白,它可以錨定、募集NMDA受體及其調(diào)節(jié)分子,在腦損傷病理機制中有重要意義。本室前期研究結(jié)果表明,腦缺血引起PSD-95酪氨酸磷酸化,這一磷酸化作用Src/Fyn所介導(dǎo),主要的磷酸化位點是Y523;PSD-95Y523的磷酸化可增強NMDA受體的功能。本研究旨在探討PSD-95Y523磷酸化是否能增強NR2A酪氨酸

2、磷酸化水平,從而上調(diào)NMDA受體功能的分子機制。
　　 方法:采用傳代培養(yǎng)的HEK293T細胞,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的方法,運用蛋白質(zhì)免疫共沉淀和免疫印跡技術(shù),觀察PSD-95Y523酪氨酸磷酸化對內(nèi)源性Src激酶活性、NR2A酪氨酸磷酸化的影響,探究NR2A-PSD-95-Src和Src-PSD-95-Pyk2的相互聯(lián)系,并采用免疫熒光技術(shù)分析NR2A的膜定位情況。采用分子克隆手段,分別構(gòu)建了不同構(gòu)型的Src真核表達載體。

3、>　　 結(jié)果:
　　 1.在HEK293T細胞中單轉(zhuǎn)染PSD-95WT或是突變體PSD-95Y523F和PSD-95Y533F,PSD-95Y523F組SrcY416的磷酸化水平低于PSD-95WT組。
　　 2.在HEK293T細胞中共轉(zhuǎn)染NRI/NR2A/PSD-95WT或是突變體PSD-95Y523F/PSD-95Y533F,PSD-95Y523F組NR2A酪氨酸磷酸化水平低于PSD-95WT組。
　　

4、3.并且,PSD-95WT的酪氨酸磷酸化促進了Src-PSD-95-NR2A的三者的相互作用,而PSD-95Y523F組則低于PSD-95WT組。
　　 4.在HEK293T細胞中共轉(zhuǎn)染活化型Src/PSD-95WT或是其突變體PSD-95Y523F/PSD-95Y533F,PSD-95WT和PSD-95Y523F對組成型活化的Src激酶Y416的磷酸化無明顯影響。
　　 5.在HEK293T細胞中共轉(zhuǎn)染Pyk2/PSD

5、-95WT或是其突變體PSD-95Y523F/PSD-95Y533F,PSD-95WT酪氨酸磷酸化促進了Pyk2對Src激酶的活化,而PSD-95Y523F組則低于PSD-95WT組。
　　 6.在HEK293T細胞中共轉(zhuǎn)染NR1/Nr2A/PSD-95WT或是突變體PSD-95Y523F/PSD-95Y533F,PSD-95WT和PSD-95Y523F組NR2A在細胞膜上的量無明顯區(qū)別。
　　 結(jié)論:
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