抑癌蛋白Smad4的酪氨酸磷酸化的研究.pdf

1、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)調(diào)控細(xì)胞多項(xiàng)功能，包括細(xì)胞增殖，分化，凋亡并決定細(xì)胞命運(yùn)。Smad4作為Co-Smad，是TGF-β信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，擔(dān)任著將細(xì)胞外信號(hào)傳遞并帶入細(xì)胞核從而調(diào)節(jié)信號(hào)通路下游基因轉(zhuǎn)錄的重要角色。
　　酪氨酸激酶是一類可以將磷酸基團(tuán)加到底物蛋白酪氨酸基團(tuán)上的酶，在細(xì)胞信號(hào)傳遞中，酪氨酸的磷酸化是一種重要信號(hào)機(jī)制。人類基因組可以編碼90種酪氨酸激

2、酶，這些酪氨酸激酶參與到細(xì)胞生長，分裂分化，生存凋亡和細(xì)胞遷移能力等的調(diào)控過程中。
　　本論文旨在建立一個(gè)蛋白酪氨酸激酶(Tyrosine Kinases，TKs)文庫，并篩選能夠催化Smad4的酪氨酸激酶。運(yùn)用免疫共沉淀試驗(yàn)(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)，磷酸化酪氨酸抗體檢測的方法篩選能夠磷酸化Smad4的酪氨酸激酶。在提取準(zhǔn)備了82個(gè)酪氨酸質(zhì)粒后并檢測篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10個(gè)可以明顯磷酸化Smad4的

3、酪氨酸激酶。我們選取了其中一個(gè)可以磷酸化Smad4的激酶c-Abl進(jìn)行深入研究。c-Abl是一種既可以存在于細(xì)胞質(zhì)也可以存在于細(xì)胞核的酪氨酸激酶，它的一種病變形式促進(jìn)慢性粒細(xì)胞性白血病(Chronic Myeloid Leukemia，CML)。所以深入探索c-Abl對(duì)于臨床應(yīng)用有著重大的意義。在本論文中，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了c-Abl對(duì)于Smad4的磷酸化，并且這種磷酸化作用依賴于c-Abl的激酶活性。通過進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了c-Abl磷酸化Sm

4、ad4的主要酪氨酸位點(diǎn)，并探究了c-Abl與Smad4相互作用的具體結(jié)構(gòu)域。運(yùn)用熒光素酶雙報(bào)告系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter)方法，本研究檢測了c-Abl對(duì)于TGF-β和BMP信號(hào)通路下游基因轉(zhuǎn)錄的影響。結(jié)果顯示，c-Abl對(duì)于TGF-β和BMP信號(hào)通路都有著明顯的抑制作用。
　　本論文主要完成Smad4的蛋白酪氨酸激酶的篩選，并且選取一個(gè)具有代表性且具有研究意義的c-Abl蛋白進(jìn)行深入研究，首次報(bào)道了c-