ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化功能位點及激活機理研究.pdf

1、高血壓腦卒中是我國發(fā)病率高、危害大的心腦血管疾病。腦血管重構是腦卒中一個關鍵的病理變化。平滑肌細胞的增殖、凋亡是腦血管重構的重要因素。本文旨在研究血管平滑肌細胞ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化功能位點及激活機理。實驗分為三個部分：
　　 第一章：ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化功能位點鑒定。
　　 本部分首先采用免疫沉淀的方法研究低滲刺激下ClC-3蛋白酪氨酸磷酸化變化情況。結果表明：
　　 ⑴穩(wěn)定表達HA與ClC-3融

2、合蛋白(HAClC-3)的A10細胞用低滲液和等滲液分別處理90s后，用antiHA antibody將HAClC-3融合蛋白免疫沉淀，用antiphosphotyrosine antibody進行免疫印跡。結果發(fā)現(xiàn)，與等滲處理90s相比，低滲刺激90s后HAClC-3蛋白的酪氨酸磷酸化水平明顯增強。
　　 ⑵經系統(tǒng)的生物信息學分析ClC-3蛋白序列后發(fā)現(xiàn)，在ClC-3蛋白上主要存在3個酪氨酸殘基位點可能發(fā)生磷酸化，分別為接近N

3、端284位酪氨酸殘基(Y284)，位于C端的572和631位酪氨酸殘基(Y572和Y631)。
　　 ⑶Y631F突變對表達的容積調節(jié)性氯電流的性質(整流性和電壓依賴性和時間依賴性失活)沒有明顯影響。經單因素方差分析，A10組、GFP空載體組、GFPClC-3組、GFPClC-3Y631F突變體組在等滲和低滲時±80mV的電流密度均有明顯差異(p＜0.05)。
　　 ⑷經單因素方差分析，A10組、GFP空載體組、GFP

4、ClC-3組、GFPClC-3Y631F突變體組在等滲時的胞內氯濃度沒有明顯差異(p＞0.05)，而在低滲時的胞內氯濃度有明顯差異(p＜0.05)。
　　 ⑸Y572F突變對表達的容積調節(jié)性氯電流的性質(整流性和電壓依賴性和時間依賴性失活)沒有明顯影響。經單因素方差分析，A10組、GFP空載體組、GFPClC-3組、GFPClC-3Y572F突變體組在等滲和低滲時±80mV的電流密度均有明顯差異(p＜0.05)。
　　

5、⑹經單因素方差分析，A10組、GFP空載體組、GFP ClC-3組、GFPClC-3Y572F突變體組在等滲時的胞內氯濃度沒有明顯差異(p＞0.05)，而在低滲時的胞內氯濃度有明顯差異(p＜0.05)。
　　 ⑺經單因素方差分析，A10組、GFP空載體組、GFPClC-3組、GFPClC-3Y284F突變體組在等滲和低滲時±80mV的電流密度均有明顯差異(p＜0.05)。
　　 ⑻經單因素方差分析，A10組、GFP空載體

6、組、GFPClC-3組、GFPClC-3Y284F突變體組在等滲時的胞內氯濃度沒有明顯差異(P＞0.05)，而在低滲時的胞內氯濃度有明顯差異(p＜0.05)。
　　 ⑼Y631Y572F突變對表達的容積調節(jié)性氯電流的性質(整流性和電壓依賴性和時間依賴性失活)沒有明顯影響。
　　 小結：①低滲刺激后ClC-3蛋白酪氨酸磷酸化水平增加。②應用生物信息學分析發(fā)現(xiàn)ClC-3蛋白主要存在三個酪氨酸殘基可能發(fā)生磷酸化，分別是Y284

7、，Y572，Y631。③Y631F突變對容積調節(jié)性ClC-3氯電流和容積調節(jié)性ClC-3氯運動沒有明顯影響。④Y572F突變可以減弱容積調節(jié)性ClC-3氯電流和容積調節(jié)性ClC-3氯運動。⑤Y284F突變顯著減弱容積調節(jié)性ClC-3氯電流和容積調節(jié)性ClC-3氯運動。⑥Y631FY572F雙位點突變體表達的容積調節(jié)性氯電流與Y631F單突變體表達電流相比有明顯差異，而與Y572F單突變體表達電流相比沒有明顯差異。⑦Y631FY284F雙

8、位點突變體表達的容積調節(jié)性氯電流與Y631F單突變體表達電流相比有明顯差異，而與Y284F單突變體表達電流相比沒有明顯差異。⑧Y572FY284F雙位點突變體表達的容積調節(jié)性氯電流與Y572F單突變體表達電流相比有明顯差異，而與Y284F單突變體表達電流相比沒有明顯差異。⑨Y631FY572FY284F三位點突變體表達的容積調節(jié)性氯電流與Y631F單突變體表達電流相比有明顯差異，與Y572F單突變體表達電流相比也有明顯差異，而與Y284

9、F單突變體表達電流相比沒有明顯差異。⑩Y284D突變顯著增強容積調節(jié)性ClC-3氯電流和容積調節(jié)性ClC-3氯運動。
　　 第二章：功能位點突變對ClC-3氯通道保護細胞凋亡作用的影響。
　　 通過在A10細胞上轉染Y284F,Y284D兩種ClC-3突變體和正常ClC-3 cDNA，運用核Hoechst染色及Anexin V和PI雙染技術，研究突變對容積調節(jié)性ClC-3通道保護TG和H2O2誘導的A10細胞凋亡的功能的

10、影響。結果如下：
　　 ⑴分別用25μM，50μM,100μM，200μMTG處理A10細胞24h后進行核Hoechst染色發(fā)現(xiàn)，25μM處理組部分細胞開始出現(xiàn)核體積縮小，熒光染色增強，少數(shù)細胞呈現(xiàn)染色質濃染和凋亡小體；100μM處理組出現(xiàn)顯著的細胞凋亡(核固縮，核碎裂，可見明顯的凋亡小體)；200μM處理組出現(xiàn)30％以上的細胞死亡漂浮于細胞培養(yǎng)液，未做進一步的核Hoechst染色。故后續(xù)實驗采用100μMTG誘導細胞凋亡。

11、r>　　 ⑵分別用50μM，100μM,200μM,400μM H2O2處理A10細胞24h后進行核Hoechst染色發(fā)現(xiàn)，100μM處理組開始出現(xiàn)細胞凋亡，200μM處理組出現(xiàn)顯著的細胞凋亡，400μM處理組出現(xiàn)15％以上的細胞死亡漂浮于細胞培養(yǎng)液，未做進一步的核Hoechst染色。故后續(xù)實驗采用200μM H2O2誘導細胞凋亡。
　　 小結：①ClC-3可以保護TG和H2O2誘導的A10細胞凋亡。②Y284F突變可以顯著減

12、弱ClC-3對TG誘導的A10細胞凋亡的保護作用，而Y284D突變可以增強ClC-3對TG誘導的A10細胞凋亡的保護作用。③Y284F突變可以顯著減弱ClC-3對H2O2誘導的A10細胞凋亡的保護作用，而Y284D突變可以增強ClC-3對H2O2誘導的A10細胞凋亡的保護作用。
　　 第三章：ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化的激活機制。
　　 研究ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化的Src激酶依賴的激活機制，運用Src激酶選擇性抑

13、制劑和基因轉染技術，研究Src激酶對ClC-3通道介導的氯電流和氯運動的調節(jié)作用，并運用免疫共沉淀的方法探討Src激酶與ClC-3蛋白的相互作用。結果如下：
　　 ⑴在大鼠基底動脈平滑肌細胞、主動脈平滑肌細胞及A10胚胎鼠主動脈平滑肌細胞株上都可檢測到Src蛋白的表達。
　　 ⑵在±80mV，低滲刺激后細胞的電流密度分別從等滲條件下的-9.0±2.4pA·pF-1和15.6±3.2pA·pF-1增加至-22.2±6.0

14、pA·pF-1和46.5±10.0 pA·pF-1(n=16，P＜0.01)。
　　 ⑶在±80mV，低滲刺激后細胞的電流密度分別從等滲條件下的-16.5±4.2pA·pF-1和34.9±8.5 pA·pF-1增加至-53.1±15.7 pA·pF-1和102.6±19.4 pA·pF-1(n=13，P＜0.05)。
　　 ⑷SrcA(活性形式Src激酶)和SrcI(非活性形式Src激酶)質粒分別轉染A10細胞，進行全細

15、胞電流記錄。未轉染的A10細胞組在等滲時的基礎電流在±80mV時分別為-6.5±2.3 pA·pF-1和14.2±3.1 pA·pF-1(n=16)，轉染空載體的A10細胞組在等滲時的基礎電流在±80mV時分別為-6.9±2.5 pA·pF-1和14.8±4.6pA·pF-1(n=6)，與未轉染的A10細胞組相比沒有明顯區(qū)別。
　　 ⑸A10細胞在等滲時細胞內氯離子濃度為30.49±1.01mM(n=30)，在低滲刺激下A10細

16、胞內氯離子濃度下降到24.17±1.03mM，氯離子濃度下降值為6.32±0.44 mM，下降率為20.72±2.53％(n=30)。
　　 小結：①血管平滑肌細胞存在Src蛋白表達。②Src蛋白酪氨酸激酶選擇性抑制劑SU6656可以濃度依賴性地抑制A10細胞和過表達ClC-3蛋白的A10細胞的容積調節(jié)性的氯電流。③活性形式的Src蛋白酪氨酸激酶增強A10細胞容積調節(jié)性的氯電流；非活性形式的Src蛋白酪氨酸激酶抑制A10細胞容積

17、調節(jié)性的氯電流。④過表達活性的Src蛋白酪氨酸激酶增強A10細胞容積調節(jié)性氯運動，過表達非活性的Src蛋白酪氨酸激酶抑制A10細胞容積調節(jié)性氯運動。⑤Src激酶與ClC-3氯通道存在蛋白質的相互作用。⑥我們結果提示Y284，Y572是Src激酶調控ClC-3氯通道的關鍵功能位點。
　　 結論：
　　 ⑴Y284，Y572是ClC-3氯通道關鍵的酪氨酸磷酸化功能位點，Y284，Y572位點的磷酸化可以增強ClC-3氯通道活

18、性，以Y284位點的作用尤為顯著。
　　 ⑵ClC-3可以保護TG和H2O2誘導的A10血管平滑肌細胞的凋亡。Y284F突變可以顯著減弱ClC-3對細胞凋亡的保護作用，Y284D突變可以顯著增強ClC-3對細胞凋亡的保護作用，提示功能位點相關的酪氨酸磷酸化信號對ClC-3參與的細胞凋亡等多種生理過程有重要影響。
　　 ⑶Src激酶直接參與了ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化功能位點(Y284，Y572)相關的通道激活機制，Sr