ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化功能位點(diǎn)及激活機(jī)理研究.pdf

1、高血壓腦卒中是我國發(fā)病率高、危害大的心腦血管疾病。腦血管重構(gòu)是腦卒中一個(gè)關(guān)鍵的病理變化。平滑肌細(xì)胞的增殖、凋亡是腦血管重構(gòu)的重要因素。本文旨在研究血管平滑肌細(xì)胞ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化功能位點(diǎn)及激活機(jī)理。實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)部分：
　　 第一章：ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化功能位點(diǎn)鑒定。
　　 本部分首先采用免疫沉淀的方法研究低滲刺激下ClC-3蛋白酪氨酸磷酸化變化情況。結(jié)果表明：
　　 ⑴穩(wěn)定表達(dá)HA與ClC-3融

2、合蛋白(HAClC-3)的A10細(xì)胞用低滲液和等滲液分別處理90s后，用antiHA antibody將HAClC-3融合蛋白免疫沉淀，用antiphosphotyrosine antibody進(jìn)行免疫印跡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與等滲處理90s相比，低滲刺激90s后HAClC-3蛋白的酪氨酸磷酸化水平明顯增強(qiáng)。
　　 ⑵經(jīng)系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析ClC-3蛋白序列后發(fā)現(xiàn)，在ClC-3蛋白上主要存在3個(gè)酪氨酸殘基位點(diǎn)可能發(fā)生磷酸化，分別為接近N

3、端284位酪氨酸殘基(Y284)，位于C端的572和631位酪氨酸殘基(Y572和Y631)。
　　 ⑶Y631F突變對表達(dá)的容積調(diào)節(jié)性氯電流的性質(zhì)(整流性和電壓依賴性和時(shí)間依賴性失活)沒有明顯影響。經(jīng)單因素方差分析，A10組、GFP空載體組、GFPClC-3組、GFPClC-3Y631F突變體組在等滲和低滲時(shí)±80mV的電流密度均有明顯差異(p＜0.05)。
　　 ⑷經(jīng)單因素方差分析，A10組、GFP空載體組、GFP

4、ClC-3組、GFPClC-3Y631F突變體組在等滲時(shí)的胞內(nèi)氯濃度沒有明顯差異(p＞0.05)，而在低滲時(shí)的胞內(nèi)氯濃度有明顯差異(p＜0.05)。
　　 ⑸Y572F突變對表達(dá)的容積調(diào)節(jié)性氯電流的性質(zhì)(整流性和電壓依賴性和時(shí)間依賴性失活)沒有明顯影響。經(jīng)單因素方差分析，A10組、GFP空載體組、GFPClC-3組、GFPClC-3Y572F突變體組在等滲和低滲時(shí)±80mV的電流密度均有明顯差異(p＜0.05)。
　　

5、⑹經(jīng)單因素方差分析，A10組、GFP空載體組、GFP ClC-3組、GFPClC-3Y572F突變體組在等滲時(shí)的胞內(nèi)氯濃度沒有明顯差異(p＞0.05)，而在低滲時(shí)的胞內(nèi)氯濃度有明顯差異(p＜0.05)。
　　 ⑺經(jīng)單因素方差分析，A10組、GFP空載體組、GFPClC-3組、GFPClC-3Y284F突變體組在等滲和低滲時(shí)±80mV的電流密度均有明顯差異(p＜0.05)。
　　 ⑻經(jīng)單因素方差分析，A10組、GFP空載體

6、組、GFPClC-3組、GFPClC-3Y284F突變體組在等滲時(shí)的胞內(nèi)氯濃度沒有明顯差異(P＞0.05)，而在低滲時(shí)的胞內(nèi)氯濃度有明顯差異(p＜0.05)。
　　 ⑼Y631Y572F突變對表達(dá)的容積調(diào)節(jié)性氯電流的性質(zhì)(整流性和電壓依賴性和時(shí)間依賴性失活)沒有明顯影響。
　　 小結(jié)：①低滲刺激后ClC-3蛋白酪氨酸磷酸化水平增加。②應(yīng)用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)ClC-3蛋白主要存在三個(gè)酪氨酸殘基可能發(fā)生磷酸化，分別是Y284

7、，Y572，Y631。③Y631F突變對容積調(diào)節(jié)性ClC-3氯電流和容積調(diào)節(jié)性ClC-3氯運(yùn)動(dòng)沒有明顯影響。④Y572F突變可以減弱容積調(diào)節(jié)性ClC-3氯電流和容積調(diào)節(jié)性ClC-3氯運(yùn)動(dòng)。⑤Y284F突變顯著減弱容積調(diào)節(jié)性ClC-3氯電流和容積調(diào)節(jié)性ClC-3氯運(yùn)動(dòng)。⑥Y631FY572F雙位點(diǎn)突變體表達(dá)的容積調(diào)節(jié)性氯電流與Y631F單突變體表達(dá)電流相比有明顯差異，而與Y572F單突變體表達(dá)電流相比沒有明顯差異。⑦Y631FY284F雙

8、位點(diǎn)突變體表達(dá)的容積調(diào)節(jié)性氯電流與Y631F單突變體表達(dá)電流相比有明顯差異，而與Y284F單突變體表達(dá)電流相比沒有明顯差異。⑧Y572FY284F雙位點(diǎn)突變體表達(dá)的容積調(diào)節(jié)性氯電流與Y572F單突變體表達(dá)電流相比有明顯差異，而與Y284F單突變體表達(dá)電流相比沒有明顯差異。⑨Y631FY572FY284F三位點(diǎn)突變體表達(dá)的容積調(diào)節(jié)性氯電流與Y631F單突變體表達(dá)電流相比有明顯差異，與Y572F單突變體表達(dá)電流相比也有明顯差異，而與Y284

9、F單突變體表達(dá)電流相比沒有明顯差異。⑩Y284D突變顯著增強(qiáng)容積調(diào)節(jié)性ClC-3氯電流和容積調(diào)節(jié)性ClC-3氯運(yùn)動(dòng)。
　　 第二章：功能位點(diǎn)突變對ClC-3氯通道保護(hù)細(xì)胞凋亡作用的影響。
　　 通過在A10細(xì)胞上轉(zhuǎn)染Y284F,Y284D兩種ClC-3突變體和正常ClC-3 cDNA，運(yùn)用核Hoechst染色及Anexin V和PI雙染技術(shù)，研究突變對容積調(diào)節(jié)性ClC-3通道保護(hù)TG和H2O2誘導(dǎo)的A10細(xì)胞凋亡的功能的

10、影響。結(jié)果如下：
　　 ⑴分別用25μM，50μM,100μM，200μMTG處理A10細(xì)胞24h后進(jìn)行核Hoechst染色發(fā)現(xiàn)，25μM處理組部分細(xì)胞開始出現(xiàn)核體積縮小，熒光染色增強(qiáng)，少數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)染色質(zhì)濃染和凋亡小體；100μM處理組出現(xiàn)顯著的細(xì)胞凋亡(核固縮，核碎裂，可見明顯的凋亡小體)；200μM處理組出現(xiàn)30％以上的細(xì)胞死亡漂浮于細(xì)胞培養(yǎng)液，未做進(jìn)一步的核Hoechst染色。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用100μMTG誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

11、r>　　 ⑵分別用50μM，100μM,200μM,400μM H2O2處理A10細(xì)胞24h后進(jìn)行核Hoechst染色發(fā)現(xiàn)，100μM處理組開始出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，200μM處理組出現(xiàn)顯著的細(xì)胞凋亡，400μM處理組出現(xiàn)15％以上的細(xì)胞死亡漂浮于細(xì)胞培養(yǎng)液，未做進(jìn)一步的核Hoechst染色。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用200μM H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 小結(jié)：①ClC-3可以保護(hù)TG和H2O2誘導(dǎo)的A10細(xì)胞凋亡。②Y284F突變可以顯著減

12、弱ClC-3對TG誘導(dǎo)的A10細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，而Y284D突變可以增強(qiáng)ClC-3對TG誘導(dǎo)的A10細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。③Y284F突變可以顯著減弱ClC-3對H2O2誘導(dǎo)的A10細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，而Y284D突變可以增強(qiáng)ClC-3對H2O2誘導(dǎo)的A10細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。
　　 第三章：ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化的激活機(jī)制。
　　 研究ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化的Src激酶依賴的激活機(jī)制，運(yùn)用Src激酶選擇性抑

13、制劑和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，研究Src激酶對ClC-3通道介導(dǎo)的氯電流和氯運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)作用，并運(yùn)用免疫共沉淀的方法探討Src激酶與ClC-3蛋白的相互作用。結(jié)果如下：
　　 ⑴在大鼠基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞、主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞及A10胚胎鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞株上都可檢測到Src蛋白的表達(dá)。
　　 ⑵在±80mV，低滲刺激后細(xì)胞的電流密度分別從等滲條件下的-9.0±2.4pA·pF-1和15.6±3.2pA·pF-1增加至-22.2±6.0

14、pA·pF-1和46.5±10.0 pA·pF-1(n=16，P＜0.01)。
　　 ⑶在±80mV，低滲刺激后細(xì)胞的電流密度分別從等滲條件下的-16.5±4.2pA·pF-1和34.9±8.5 pA·pF-1增加至-53.1±15.7 pA·pF-1和102.6±19.4 pA·pF-1(n=13，P＜0.05)。
　　 ⑷SrcA(活性形式Src激酶)和SrcI(非活性形式Src激酶)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染A10細(xì)胞，進(jìn)行全細(xì)

15、胞電流記錄。未轉(zhuǎn)染的A10細(xì)胞組在等滲時(shí)的基礎(chǔ)電流在±80mV時(shí)分別為-6.5±2.3 pA·pF-1和14.2±3.1 pA·pF-1(n=16)，轉(zhuǎn)染空載體的A10細(xì)胞組在等滲時(shí)的基礎(chǔ)電流在±80mV時(shí)分別為-6.9±2.5 pA·pF-1和14.8±4.6pA·pF-1(n=6)，與未轉(zhuǎn)染的A10細(xì)胞組相比沒有明顯區(qū)別。
　　 ⑸A10細(xì)胞在等滲時(shí)細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度為30.49±1.01mM(n=30)，在低滲刺激下A10細(xì)

16、胞內(nèi)氯離子濃度下降到24.17±1.03mM，氯離子濃度下降值為6.32±0.44 mM，下降率為20.72±2.53％(n=30)。
　　 小結(jié)：①血管平滑肌細(xì)胞存在Src蛋白表達(dá)。②Src蛋白酪氨酸激酶選擇性抑制劑SU6656可以濃度依賴性地抑制A10細(xì)胞和過表達(dá)ClC-3蛋白的A10細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)性的氯電流。③活性形式的Src蛋白酪氨酸激酶增強(qiáng)A10細(xì)胞容積調(diào)節(jié)性的氯電流；非活性形式的Src蛋白酪氨酸激酶抑制A10細(xì)胞容積

17、調(diào)節(jié)性的氯電流。④過表達(dá)活性的Src蛋白酪氨酸激酶增強(qiáng)A10細(xì)胞容積調(diào)節(jié)性氯運(yùn)動(dòng)，過表達(dá)非活性的Src蛋白酪氨酸激酶抑制A10細(xì)胞容積調(diào)節(jié)性氯運(yùn)動(dòng)。⑤Src激酶與ClC-3氯通道存在蛋白質(zhì)的相互作用。⑥我們結(jié)果提示Y284，Y572是Src激酶調(diào)控ClC-3氯通道的關(guān)鍵功能位點(diǎn)。
　　 結(jié)論：
　　 ⑴Y284，Y572是ClC-3氯通道關(guān)鍵的酪氨酸磷酸化功能位點(diǎn)，Y284，Y572位點(diǎn)的磷酸化可以增強(qiáng)ClC-3氯通道活

18、性，以Y284位點(diǎn)的作用尤為顯著。
　　 ⑵ClC-3可以保護(hù)TG和H2O2誘導(dǎo)的A10血管平滑肌細(xì)胞的凋亡。Y284F突變可以顯著減弱ClC-3對細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，Y284D突變可以顯著增強(qiáng)ClC-3對細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，提示功能位點(diǎn)相關(guān)的酪氨酸磷酸化信號對ClC-3參與的細(xì)胞凋亡等多種生理過程有重要影響。
　　 ⑶Src激酶直接參與了ClC-3氯通道酪氨酸磷酸化功能位點(diǎn)(Y284，Y572)相關(guān)的通道激活機(jī)制，Sr