氯通道ClC-3、ClC-4和ClC-5在成骨細胞分化中的作用.pdf

1、研究背景：
　　在人的一生中骨總是在不斷的改建與重塑，正畸治療正是利用骨吸收與骨改建的原理治療錯牙合畸形的一門學(xué)科，因此對于骨形成與骨改建機理的揭示對于正畸治療理論基礎(chǔ)研究是至關(guān)重要的。成骨細胞是參與骨形成及骨改建過程的重要細胞，成骨細胞的增殖、分化及調(diào)控是骨形成機理研究的重要內(nèi)容。研究表明許多因素參與調(diào)節(jié)細胞的成骨分化，已發(fā)現(xiàn)有許多離子通道與細胞的成骨分化有關(guān)，如Ca2+、K+等，作為體內(nèi)最主要的陰離子通道——氯通道在成骨分化中

2、的作用還知之甚少。
　　近年來，隨著對氯通道結(jié)構(gòu)的深入認識，和一些與氯通道基因突變相關(guān)的人類遺傳性疾病的發(fā)現(xiàn)與研究，氯通道在生物體內(nèi)的重要作用越來越引起了人們的關(guān)注。ClC型氯通道是一大類電壓門控型的氯通道，構(gòu)成了一個大的基因家族。其中，ClC-3、ClC-4和ClC-5為內(nèi)體系統(tǒng)的ClC型氯通道，由于其基因序列的高度相似性組成了ClC型氯通道家族的一個分支，主要參與神經(jīng)細胞突觸囊泡和細胞內(nèi)體的酸化作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)體系統(tǒng)的

3、ClC型氯通道基因敲除的小鼠表現(xiàn)出生長阻滯及骨發(fā)育的異常，提示我們ClC-3、ClC-4和ClC-5可能與細胞的成骨分化有關(guān)。
　　研究目的：
　　本研究目的在于觀察ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因在成骨細胞分化過程中的表達變化，從而進一步探求ClC-3、ClC-4和ClC-5在成骨細胞分化中的作用，并初步研究分析其作用機制。
　　研究方法：
　　體外分離、培養(yǎng)并鑒定小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，原代培養(yǎng)小鼠

4、顱頂骨來源的成骨細胞及小鼠成骨前體細胞系MC3T3-E1，利用RT-PCR方法檢測ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因在以上三種成骨譜系細胞中的表達。利用成骨條件培養(yǎng)液對MC3T3-E1細胞進行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，用RT-PCR及real-timePCR方法檢測細胞成骨誘導(dǎo)過程中ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因的表達變化。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染含ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因全長的質(zhì)粒，構(gòu)建瞬時過表達ClC-3、Cl

5、C-4和ClC-5氯通道基因的MC3T3-E1細胞體系。同樣，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因的干擾siRNA，構(gòu)建干擾ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因表達的MC3T3-E1細胞體系。用RT-PCR及real-timePCR方法檢測兩種基因表達體系中，成骨相關(guān)基因的表達變化。在基因過表達體系中，檢測細胞體外礦化能力的變化，并檢測細胞內(nèi)細胞器的酸堿變化。用細胞免疫熒光方法，利用激光共聚焦顯微鏡對MC3

6、T3-E1細胞中的氯通道及TGF-β1進行定位。分析前期研究結(jié)果，進一步對氯通道在成骨分化中的作用機制進行研究。
　　研究結(jié)果：
　　RT-PCR結(jié)果顯示，在小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞、原代培養(yǎng)小鼠顱頂成骨細胞以及小鼠成骨前體細胞系MC3T3-E1細胞中均有ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因的陽性表達。在MC3T3-E1細胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)中，伴隨成骨相關(guān)基因ALP、BSP、OC、Runx2的表達增強，ClC-3、ClC-4

7、和ClC-5氯通道基因的表達也顯著增強。在過表達ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因的MC3T3-E1細胞中，成骨相關(guān)基因ALP、BSP、OC、Runx2的表達增強，細胞內(nèi)內(nèi)體系統(tǒng)的酸化作用加強，細胞體外的礦化能力明顯加強。在干擾了ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道基因表達的MC3T3-E1細胞中，成骨相關(guān)基因ALP、BSP、OC、Runx2的表達顯著降低。在細胞免疫熒光實驗中發(fā)現(xiàn)，ClC-3氯通道定位于細胞內(nèi)核周圍內(nèi)體和

8、溶酶體等細胞器。ClC-3與TGF-β1的表達有共定位，且過表達ClC-3基因能明顯下調(diào)TGF-β1的表達。在過表達ClC-3基因的MC3T3-E1細胞中，干擾Runx2的基因表達后，成骨相關(guān)基因ALP、BSP、OC、Runx2、Osx的表達被明顯抑制。
　　結(jié)論：
　　ClC-3、ClC-4和ClC-5氯通道存在于小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞、原代培養(yǎng)小鼠顱頂成骨細胞以及小鼠成骨前體細胞系MC3T3-E1等成骨譜系細胞中。ClC-