ClC-3氯通道過表達對小鼠骨骼的影響.pdf

1、目的：骨的生長代謝由多種因素參與調(diào)控，研究表明骨的生長代謝與Ca2+、K+等多種離子通道相關(guān)。氯離子通道廣泛分布于多種組織，電壓門控氯通道家族蛋白成員3（voltage-gated chloride channel family protein3。ClC-3）作為ClC型氯離子家族通道中一種重要的亞型，在成骨細胞和破骨細胞上均有表達并且參與了成骨細胞的骨形成與破骨細胞的骨吸收，提示其與骨代謝有著密切的關(guān)系。但目前尚不了解ClC-3氯通道

2、對骨代謝的具體作用及作用機制。本研究以ClC-3過表達小鼠為主要研究對象，觀察脛骨松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨的骨量與骨結(jié)構(gòu)的變化及股骨生物力學的改變，并探討這些改變的可能因素，以了解小鼠ClC-3氯通道對骨代謝的影響。
　　方法：導入含有CLCN3基因和綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的質(zhì)粒構(gòu)建ClC-3氯通道過表達的FVB小鼠，鼠尾基因檢測確定并選擇ClC-3過表達型（ClC-3 transge

3、ne）小鼠為主要研究對象。實驗主要分為野生型（WT）組和ClC-3過表達型組。每組小鼠從出生開始，每隔一個月測量體重及體長，每組在飼養(yǎng)至一月齡，三月齡，九月齡時分別取雄性和雌性小鼠各10只處死并分離出右側(cè)脛骨和股骨作為實驗研究對象。測量脛骨的重量和長度。對脛骨上段（proximal tibial metaphysis，PTM）和脛骨中段（middle part of tibia shaft。TX）進行脫鈣，石蠟包埋，切片。切片脫蠟后熒光

4、拍照進一步確認小鼠的基因型。切片HE染色后骨形態(tài)計量學分析脛骨上段松質(zhì)骨的骨量參數(shù)即骨小梁面積百分數(shù)（percent trabecular area,％Tb.Ar）和骨結(jié)構(gòu)參數(shù)即骨小梁數(shù)量（trabecular number。Tb.N）、骨小梁寬度（trabecular width。Tb.Wi）和骨小梁分離度（trabecular separation。Tb.Sp）；分析脛骨中段皮質(zhì)骨的骨組織總面積（total tissue area。

5、T.Ar）、皮質(zhì)骨面積（cortical area。Ct.Ar）、皮質(zhì)骨面積百分數(shù)（percent cortical area,%Ct.Ar）、骨髓腔面積（marrow area。Ma.Ar）、骨髓腔面積百分數(shù)（percent marrow area,%Ma.Ar）的變化。對股骨行三點彎曲骨生物力學測試并分析最大載荷和最大應(yīng)力的變化。進一步檢測比較WT組和ClC-3 transgene組堿性磷酸酶（alkaline phosphatas

6、e。ALP）表達的高低。
　　結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)基因小鼠基因檢測
　　小鼠經(jīng)鼠尾DNA檢測后確認為野生型或ClC-3過表達型，石蠟切片的熒光拍照圖片進一步確認小鼠基因型。成功構(gòu)建ClC-3過表達小鼠。
　　2. ClC-3過表達對小鼠體重和體長的影響
　　（1）雌性小鼠體重和體長變化
　　隨著時間的增長WT組在一月齡至七月齡時體重逐漸增加，八月齡至九月齡時體重大幅增加，ClC-3 transgene組

7、小鼠體重呈現(xiàn)相同趨勢。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠在各月齡中體重均有減輕，且在二月齡和三月齡時其減少有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　隨著時間的增長WT組在一月齡至九月齡時體長逐漸增加，ClC-3 transgene組小鼠體長呈現(xiàn)相同趨勢。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠在各月齡中體長均有減小，且在二月齡和三月齡時其減少有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　?。?）雄性小鼠體重和體長變化

8、
　　隨著時間的增長WT組在一月齡至七月齡是體重逐漸增加，八月齡至九月齡時體重略有減輕，ClC-3 transgene組小鼠體重呈現(xiàn)相同趨勢。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠在各月齡中體重均有減輕，且在二月齡和三月齡時其減少有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　隨著時間的增長WT組在一月齡至九月齡時體長逐漸增加，ClC-3 transgene組小鼠體長呈現(xiàn)相同趨勢。與WT組相比，ClC-3 transgene

9、組小鼠在各月齡中體長均有減小，且在二月齡至四月齡時其減少有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　3. ClC-3過表達對小鼠脛骨重量和長度的影響
　　（1）雌性小鼠脛骨重量和長度變化
　　隨著時間的增長WT組脛骨重量在一月齡至七月齡時逐漸增加，八月齡至九月齡時略有減輕。ClC-3 transgene組脛骨重量在一月齡至八月齡時逐漸增加，九月齡時略有減輕。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠在各月齡中脛骨重量均

10、有減小，且在一月齡至四月齡時其減少有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　隨著時間的增長WT組脛骨長度在一月齡至九月齡時逐漸增加。ClC-3 transgene組小鼠脛骨長度呈現(xiàn)相同趨勢。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠在各月齡中脛骨長度均有減小，且在一月齡和二月齡時其減少有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　?。?）雄性小鼠脛骨重量和長度變化
　　隨著時間的增長WT組脛骨重量在一月齡至四月齡時逐漸增加，五月

11、齡至九月齡時基本平穩(wěn)。ClC-3 transgene組脛骨重量在一月齡至九月齡時逐漸增加。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠在各月齡中脛骨重量均有減小，且在一月齡至四月齡時其減少有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　隨著時間的增長WT組脛骨長度在一月齡至九月齡時逐漸增加。ClC-3 transgene組小鼠脛骨長度呈現(xiàn)相同趨勢。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠在各月齡中脛骨長度均有減小，且在二月齡和

12、四月齡時其減少有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　4. ClC-3過表達對小鼠脛骨上段松質(zhì)骨影響
　　（1）雌性小鼠脛骨上段松質(zhì)骨變化
　　WT組骨量參數(shù)即%Tb.Ar在一月齡至三月齡中逐漸增大，在九月齡時減小。骨結(jié)構(gòu)參數(shù)Tb.Wi及Tb.N在一月齡至三月齡中逐漸增大，在九月齡時減小；Tb.Sp在一月齡至三月齡中逐漸減小，在九月齡時增大。ClC-3 transgene組骨量和骨結(jié)構(gòu)參數(shù)呈現(xiàn)相同趨勢。與WT組相比，ClC

13、-3 transgene組小鼠各月齡的%Tb.Ar、Tb.Wi和Tb.N均有減小，Tb.Sp均有增大，且ClC-3 transgene組%Tb.Ar在一月齡和三月齡的減少有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01），Tb.Wi在三月齡的減少有統(tǒng)計學意義（P<0.05），Tb.Sp在三月齡的增加有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　?。?）雄性小鼠脛骨上段松質(zhì)骨變化
　　WT組骨量參數(shù)即%Tb.Ar在一月齡至三月齡中逐漸增大，在九月

14、齡時大幅減小。骨結(jié)構(gòu)參數(shù)Tb.Wi及Tb.N在一月齡至三月齡中逐漸增大，在九月齡時減??；Tb.Sp在一月齡至三月齡中逐漸減小，在九月齡時增大。ClC-3 transgene組骨量和骨結(jié)構(gòu)參數(shù)呈現(xiàn)相同趨勢。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠各月齡的%Tb.Ar、Tb.Wi和Tb.N均有減小，且ClC-3 transgene組%Tb.Ar在一月齡的減少有統(tǒng)計學意義（P<0.01），在三月齡的減少也有統(tǒng)計學意義（P<0.05）

15、。Tb.Wi在一月齡和三月齡的減少有統(tǒng)計學意義（P<0.05），Tb.Sp在三月齡的增加有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　5. ClC-3過表達對小鼠脛骨中段皮質(zhì)骨影響
　　（1）雌性小鼠脛骨中段皮質(zhì)骨變化
　　WT組骨量絕對參數(shù)即T.Ar和Ct.Ar在一月齡至九月齡時隨時間變化逐漸增大；相對參數(shù)%Ct.Ar在一月齡至三月齡時逐漸增大，在九月齡時減少；Ma.Ar和%Ma.Ar在一月齡至三月齡時逐漸減少，在九月齡時增加

16、。ClC-3 transgene組骨量參數(shù)呈現(xiàn)相同的趨勢。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠各月齡的T.Ar、Ct.Ar和%Ct.Ar均有減少，Ma.Ar和%Ma.Ar均有增加，且T.Ar在三月齡時的變化有統(tǒng)計學意義（P<0.05），Ct.Ar、%Ct.Ar和%Ma.Ar在三月齡和九月齡時的變化有統(tǒng)計學意義（P<0.05），Ma.Ar在九月齡時的變化有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　?。?）雄性小鼠脛骨中段皮質(zhì)骨變

17、化
　　WT組骨量絕對參數(shù)即T.Ar、Ct.Ar和相對參數(shù)%Ct.Ar在一月齡至三月齡時隨時間變化逐漸增大，在三月齡至九月齡時基本保持穩(wěn)定；Ma.Ar和%Ma.Ar在一月齡至三月齡逐漸減小，在三月齡至九月齡時基本保持穩(wěn)定。ClC-3 transgene組骨量參數(shù)呈現(xiàn)相同的趨勢。與WT組相比，ClC-3 transgene組小鼠各月齡的T.Ar、Ct.Ar和%Ct.Ar均有減少，Ma.Ar和%Ma.Ar均有增加，且T.Ar在三月齡時

18、的變化有統(tǒng)計學意義（P<0.05），Ct.Ar、%Ct.Ar、Ma.Ar和%Ma.Ar在三月齡和九月齡時的變化有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　6. ClC-3過表達對小鼠股骨生物力學的影響
　　（1）雌性小鼠股骨生物力學變化
　　WT組最大載荷在一月齡至三月齡中逐漸增大，在九月齡時減小。ClC-3 transgene組呈現(xiàn)相同的趨勢。與WT組相比，ClC-3 transgene組的最大載荷在各月齡均有減少，且在三月

19、齡時其減小有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　WT組最大應(yīng)力在一月齡至三月齡中逐漸增大，在九月齡時減小。ClC-3 transgene組呈現(xiàn)相同的趨勢。與WT組相比，ClC-3 transgene組的最大應(yīng)力在各月齡均有減少，且在三月齡時其減小有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　?。?）雄性小鼠股骨生物力學變化
　　WT組最大載荷在一月齡至三月齡中增大，在九月齡時減小。ClC-3 transgene組呈現(xiàn)相同的趨勢。與W

20、T組相比，ClC-3 transgene組的最大載荷在各月齡均有減少，且在三月齡時其減小有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　WT組最大應(yīng)力在一月齡至三月齡中增大，在九月齡時減小。ClC-3 transgene組呈現(xiàn)相同的趨勢。與WT組相比，ClC-3 transgene組的最大應(yīng)力在各月齡均有減少，且在一月齡和三月齡時其減小有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　7. ClC-3過表達對小鼠堿性磷酸酶水平的影響
　　與WT

21、組相比，ClC-3 transgene組堿性磷酸酶水平的表達減少（P<0.05）。
　　結(jié)論：ClC-3氯通道過表達明顯的影響骨骼的生長發(fā)育，表現(xiàn)為小鼠體重、體長、脛骨的長度和重量的改變；特別是松質(zhì)骨骨小梁骨量的減少和骨結(jié)構(gòu)的破壞；皮質(zhì)骨骨外膜面骨量減少和骨內(nèi)膜骨髓腔增大，使皮質(zhì)骨絕對值和相對值骨量都減少，這些結(jié)果影響骨骼的材料力學和結(jié)構(gòu)力學的性能，導致骨質(zhì)量的降低。骨生物力學結(jié)果顯示ClC-3氯通道過表達可能對雌性小鼠骨質(zhì)量影響