腺病毒介導的PUMA過表達對小鼠肝再生的影響.pdf

1、促凋亡蛋白PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis)作為重要的p53靶分子，屬于凋亡相關蛋白Bcl-2家族，是BH3-only亞族的重要成員，僅擁有一個BH3結構域，通過和其他家族成員的相互作用，發(fā)揮轉(zhuǎn)導凋亡信號的功能，在凋亡信號通路中處于中心位置。此外，它在進化上極端保守，例如小鼠和人PUMA的基因同源性為91％，蛋白質(zhì)同源性為90％；puma基因通過可變剪接能夠產(chǎn)生多個轉(zhuǎn)錄本，其中有活

2、性的產(chǎn)物主要是PUMA-α(23kDa)和PUMA-β(18kDa)。 在生理狀態(tài)下PUMA受到嚴格地調(diào)控，基礎表達量較低；但在多種應激因素(如DNA損傷，缺氧，糖皮質(zhì)激素及血清撤除等)刺激下，可通過p53依賴和非依賴兩條途徑被誘導，產(chǎn)生顯著的促凋亡效應。 由于肝再生過程中涉及到多個Bcl-2家族成員(如Bcl-2，Bcl-XL，Bax等)參與，但它們在肝再生早期的表達關系難以解釋此時細胞凋亡罕見的現(xiàn)象；此外BH3-on

3、ly亞族分子對肝再生的調(diào)控作用未知，因此我們選擇了和已知的肝再生凋亡通路關系密切的PUMA作為研究的切入點，運用腺病毒介導的基因過表達技術，探討它對肝再生早期的影響及其作用機制。 本課題研究的主要內(nèi)容是：1、肝再生早期PUMA及其相關基因的表達變化：2、腺病毒介導基因過表達模型的建立；3、過表達PUMA對肝再生的影響。 首先，我們通過Western blotting、Real time PCR和免疫組織化學研究發(fā)現(xiàn)，PU

4、MA在肝內(nèi)圍繞小葉中央靜脈呈極性分布，其基礎表達量較低；在肝再生早期(0h～72h)PUMA在mRNA和蛋白水平均發(fā)生顯著下調(diào)，這種依賴轉(zhuǎn)錄的表達下調(diào)和轉(zhuǎn)錄抑制因子Slug的上調(diào)存在一定的相關性，而和p53在肝再生早期的上調(diào)無關；與其密切相關的Bcl-2家族成員Bcl-XL和Bax在蛋白水平均逐漸上調(diào)，并且Bax的變化與p53相關，然而凋亡效應酶Caspase3卻未見激活。 為了解這些現(xiàn)象之間的內(nèi)在聯(lián)系，我們于是采用腺病毒介導的

5、基因轉(zhuǎn)移技術，通過尾靜脈注射的方法使重組腺病毒Ad-PUMA和腺病毒空載體Ad-GFP感染C57小鼠肝臟，令外源基因在肝臟過表達，爾后進行部分肝臟切除術，檢測術后24h再生肝細胞的增殖和凋亡情況。結果發(fā)現(xiàn)用高劑量(4×108ifu)Ad-GFP感染小鼠，可以獲得約30％的肝臟感染效率，并能在注射后3～8天維持外源基因的表達，對術后1～5天的再生肝重量無明顯影響；而用極高劑量(1×109ifu)和高劑量(4×108ifu)Ad-PUMA注

6、射小鼠會誘導急性肝衰竭，注射后48h死亡率分別為100％和35.7％，組織學檢測顯示肝細胞出現(xiàn)明顯水腫、壞死，肝門部位嚴重出血和炎細胞侵潤。低劑量(2×108ifu)Ad-PUMA預處理后，術前未見小鼠急性期死亡，肝臟也無異常表現(xiàn)，但術后24h死亡率驟升至66.7％，解剖見殘余肝臟腫脹明顯，組織學檢測Ad-PUMA的肝臟感染效率僅約10％；Western blotting檢測術后24h PUMA較正常水平僅上調(diào)約1倍；PCNA和TUNE

7、L染色表明再生肝細胞增殖減少，凋亡增多，并伴有明顯的炎癥改變；Ad-PUMA感染后能使Bcl-XL反應延遲并上調(diào)Bax水平。與此對照，Ad-GFP在相同劑量下并不會引起小鼠急性期死亡和明顯的炎癥反應，也不顯著升高術后24h死亡率，同溶劑組(注射等體積PBS)比較亦無明顯差異。 因此我們認為腺病毒介導的基因轉(zhuǎn)移技術可以高效地使外源基因在肝臟表達，并且腺病毒載體本身在當前的劑量下不會產(chǎn)生顯著的肝臟毒性，經(jīng)Ad-GFP注射后小鼠的手術

8、耐受性好，腺病毒載體并不影響再生肝的重量，不會干擾肝再生的總體進程。 而PUMA的輕度過表達即可影響早期肝再生進程，引起明顯的肝臟病理改變，說明它的下調(diào)對肝再生具有非常積極的意義，這可能是術后殘余肝細胞在再生早期抵御凋亡的機制之一。其生理意義在于：通過調(diào)節(jié)PUMA的表達水平來發(fā)揮肝細胞的自我保護作用，降低肝細胞對外界不良刺激的敏感性，提高對凋亡的反應閾值，有利于肝細胞進入增殖周期。其作用機制可能包括在Slug調(diào)節(jié)下轉(zhuǎn)錄受抑，從而