重組腺病毒介導(dǎo)Sox9表達(dá)對人椎間盤細(xì)胞退變的影響.pdf

1、研究背景：
　　腰背部疼痛是當(dāng)今困擾人類的最常見骨科疾病之一，其原因有椎間盤退行性變、腰背部肌肉勞損等，其中有約4/5的病人是以下腰痛為主要病癥來醫(yī)院就診，下腰痛的最主要原因是椎間盤的退行性變。學(xué)者發(fā)現(xiàn)，椎間盤的退行性變與組織形態(tài)學(xué)、生物力學(xué)、遺傳學(xué)、基因分子學(xué)等有關(guān)。椎間盤是脊柱的重要組成部分，其在維持脊柱生理曲度及穩(wěn)定性方面起著重要的作用。其主要有周圍的纖維化組織，中間的髓核組織，以及上下的軟骨終板組成，為脊柱應(yīng)力緩沖的主要結(jié)

2、構(gòu)，起著彈性墊作用。椎間盤退變，在外力的作用下，其纖維環(huán)組織退變并破裂，中間的髓核組織通過破裂纖維環(huán)的缺口處脫出或者突出后方的椎管內(nèi)，壓迫相應(yīng)的脊髓和神經(jīng)，脊髓和神經(jīng)長期受壓，發(fā)生水腫、炎癥，進(jìn)而引起腰背痛、下肢無力、疼麻等為主、甚至截癱的臨床癥狀。陳立等人對椎間盤退行性變的研究表明，在正常的生物應(yīng)力作用下，軟骨終板上的蛋白聚糖合成和降解二者處于動態(tài)平衡，而在異常應(yīng)力的作用下，軟骨終板的蛋白聚糖出現(xiàn)合成減少、但是降解增加，打破了這種動態(tài)

3、平衡，從而改變了椎間盤的原有組織結(jié)構(gòu)成分，最終導(dǎo)致了椎間盤的退行性變。成年后的椎間盤細(xì)胞及組織失去了血液的營養(yǎng)供給，其營養(yǎng)主要依靠終板和纖維環(huán)的擴(kuò)散方式來獲取，而隨著年齡的增加，椎體的終板逐漸出現(xiàn)鈣化甚至硬化，致使椎間盤的營養(yǎng)途徑被切斷，而導(dǎo)致椎間盤的退行性變。目前相關(guān)學(xué)者的主要研究方向集中在椎間盤退行性變的臨床治療方法，目前針對椎間盤退行性變的主要方案相關(guān)的保守治療以及不同方式的手術(shù)治療，保守治療包括相應(yīng)的藥物治療、理療及臥床休息等，

4、僅能暫時起到緩解或部分緩解臨床癥狀的效果，在身體勞累或者其他應(yīng)力改變的情況下，上述癥狀會再次出現(xiàn)，甚至加重。而隨著20世紀(jì)40年代，Jaslow和Clowoud等人將后路腰椎椎間融合術(shù)（Postive Lumbar Interbody Fusion PLIF）的方法引入臨床應(yīng)用，臨床上開始應(yīng)用減壓融合術(shù)來治療椎間盤退行性變，其可明顯的改善臨床癥狀，但改變了脊柱本身的應(yīng)力結(jié)構(gòu)，對鄰近階段以及整個脊柱的生物力學(xué)的影響，暫時并不十分確切，上述

5、方法雖能緩解或者部分緩解椎間盤退行性變引起的臨床癥狀，但均無法從根本上來治療椎間盤的退行性變。如何早期發(fā)現(xiàn)、并徹底治療椎間盤的退行性變逐漸成了學(xué)者們研究的熱點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，學(xué)者們開始著手對椎間盤退行性變的機(jī)制上進(jìn)行基礎(chǔ)研究，并有部分學(xué)者開始使用動物模型來模擬椎間盤退行性變進(jìn)行基因治療，并獲得了可靠的療效。
　　目前研究的基因主要包括椎間盤結(jié)構(gòu)相關(guān)基因（COLlAl基因、Sox9基因、COL9A2、COL9A3基因、COL

6、llA2基因、PG基因、CILP基因等）、骨質(zhì)疏松相關(guān)基因（維生素D受體基因、雌激素受體基因）、椎間盤代謝相關(guān)基因（MMP-1、MMP3基因、TIMP-1、COX-2基因、TIMP-1和COX-2基因、THBS-2基因、ADH基因等）、細(xì)胞因子相關(guān)基因（炎癥相關(guān)基因、生長因子類基因等）以及信號傳導(dǎo)通路相關(guān)基因（GTP環(huán)化水解酶(GCHl)等）。而在這其中Sox9基因因其獨(dú)特的生物學(xué)作用成為研究的熱點(diǎn)。
　　Sox9基因在Sox基因

7、家族中占據(jù)著重要的地位，它主要調(diào)控著人以及脊椎動物的生長發(fā)育，在軟骨生成修復(fù)和決定性別方面起著決定作用。1994年，F(xiàn)oster等運(yùn)用熒光原位雜交等技術(shù)，在染色體的17q24位上發(fā)現(xiàn)人類Sox9基因。Wagner等通過快速擴(kuò)增cDNA末端結(jié)合人胚胎腦的cDNA文庫篩選的方法，成功分離和克隆了人類Sox9基因。
　　隨著分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展以及對椎間盤退行性變機(jī)制研究的不斷深入，從越來越多的相關(guān)試驗(yàn)證據(jù)中，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)椎間盤的發(fā)育

8、、成熟到退變的整個變化過程均有Sox9基因的參與。如今，學(xué)者們對Sox9基因可促進(jìn)Ⅱ型膠原蛋白、蛋白聚糖的生成以及細(xì)胞增殖的作用已十分明確，并對相關(guān)調(diào)控機(jī)制也有了很多了解。Gruber等收集了37例（年齡從15-76歲）人類椎間盤纖維環(huán)做Sox9基因的免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)在年輕人的纖維環(huán)細(xì)胞中甚至髓核細(xì)胞中Sox9基因呈均勻染色，隨著年齡的增加以及椎間盤的退行性變，纖維環(huán)細(xì)胞中的Sox9基因染色逐漸的減少甚至消失。
　　已有學(xué)者研究

9、證實(shí)，在關(guān)節(jié)炎等相關(guān)疾病中高度表達(dá)的致炎因子可以明顯的抑制Sox9基因的生物學(xué)作用，從而減弱了病變軟骨的再生和修復(fù)能力，而在椎間盤退行性變過程中，Sox9基因的生物學(xué)作用是否也被抑制，從而使得退變的椎間盤難以自身修復(fù)，在椎間盤退行性變的過程中是否存在Sox9基因的點(diǎn)突變、調(diào)控方面的缺陷及為何會出現(xiàn)Sox9基因的表達(dá)降低等問題有待進(jìn)一步地研究。故構(gòu)建安全、可靠、有效的Sox9基因重組腺病毒載體對相關(guān)的研究十分必要，以往學(xué)者使用較多的AdE

10、asy系統(tǒng)進(jìn)行腺病毒載體的構(gòu)建，其在保存和產(chǎn)生效率方面均存在缺陷。而AdMax系統(tǒng)腺病毒包裝系統(tǒng)具有操作性簡便、病毒重組效率高、基因突變率低、病毒生產(chǎn)率高等優(yōu)勢，選用其構(gòu)建相關(guān)Sox9基因的腺病毒載體，可為進(jìn)一步研究Sox9基因在椎間盤退行性變中的作用及相關(guān)機(jī)制提供穩(wěn)定可靠的腺病毒載體。
　　應(yīng)用構(gòu)建的Sox9腺病毒載體感染所培養(yǎng)的人椎間盤髓核細(xì)胞，并觀察該細(xì)胞中Ⅱ型膠原蛋白及蛋白聚糖的含量發(fā)生的變化，以徹底了解該基因?qū)θ俗甸g盤的

11、生物學(xué)效應(yīng)。
　　目的：
　　應(yīng)用AdMax包裝系統(tǒng)構(gòu)建Sox9基因的腺病毒載體，并對其進(jìn)行鑒定，為Sox9基因的相關(guān)研究提供可靠地腺病毒載體。將含Sox9基因的該腺病毒載體感染人椎間盤髓核細(xì)胞，了解其對人椎間盤細(xì)胞的生物學(xué)作用。
　　方法：
　　1.腺病毒載體建立法運(yùn)用PCR方法對Sox9基因進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的基因篩選后重組入線性化的pAV-MCMV-GFP-3FLAG，然后轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)化

12、子；運(yùn)用菌落PCR技術(shù)對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定，鑒定完畢后，所得到的轉(zhuǎn)化子通過AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞，并在其中進(jìn)行包裝成熟、擴(kuò)增。
　　2.腺病毒載體的檢測方法應(yīng)用Western Blot檢測法對Sox9基因重組腺病毒進(jìn)行檢測，把建立的腺病毒載體的病毒DNA進(jìn)行PCR鑒定、免疫熒光組化測定以及基因測序，并進(jìn)行病毒滴度測定。
　　3.培養(yǎng)人退變椎間盤髓核細(xì)胞并感染鑒定好的Sox9基因載體，并通過免疫熒光染色了解

13、退變椎間盤髓核細(xì)胞的中Ⅱ型膠原蛋白的變化。
　　結(jié)果：
　　在以Sox9基因?yàn)槟０錚CR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物大?。?565bp，并經(jīng)測序結(jié)果與Sox9基因?qū)Ρ确治觯砻麝栃钥寺∨cSox9基因一致，說明Sox9基因擴(kuò)增成功。把獲得的病毒DNA進(jìn)行PCR鑒定，得到1565bp片段，說明Sox9基因片段已經(jīng)重組進(jìn)入腺病毒。腺病毒的滴度為：2.3×1011PFU/ml。通過Western Blot檢測，在72-95KDa之間可以看到陽性條