MGF對(duì)人退變椎間盤(pán)軟骨終板干細(xì)胞的影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　腰椎間盤(pán)退行性病變(degenerative disc disease，DDD)是人類的一類較嚴(yán)重的慢性病，也是導(dǎo)致腰部疼痛(low back pain，LBP)發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵誘因，在很大程度上致使了人類生活幸福感得下降。如今臨床上用來(lái)對(duì)付DDD的主流方法是手術(shù)療法和保守療法這兩大措施。其中手術(shù)療法一般是椎間盤(pán)融合術(shù)以及髓核切除術(shù)這兩種主流通行的手術(shù)途徑。雖然手術(shù)治療能夠在一定程度上通過(guò)去除病變組織從而緩解患者的痛

2、苦，但是這并沒(méi)有從根本上去解決椎間盤(pán)退變所導(dǎo)致的功能缺失。近些年，快速前進(jìn)的生物學(xué)基礎(chǔ)領(lǐng)域，帶給了脊柱外科一些新的防治手段，結(jié)合生物組織工程應(yīng)用、干細(xì)胞治療，不少學(xué)者提出這二者的結(jié)合可能是防治DDD的新方法。此前的報(bào)道顯示髓核(Nucleus pulposus，NP)的營(yíng)養(yǎng)是由椎間盤(pán)中的軟骨終板(cartilage endplate，CEP)組織是供應(yīng)的，且CEP還是其主要的通道，因此不少研究者認(rèn)為如果CEP發(fā)生退化，也將成為誘使椎間盤(pán)

3、退行性病變發(fā)生的關(guān)鍵誘因之一。2011年，CEP中存在著干性細(xì)胞的這一現(xiàn)象首先被我們的研究小組發(fā)現(xiàn)，這類干性細(xì)胞被稱為軟骨終板干細(xì)胞(cartilageendplate derived stem cells，CESCs)。此外研究小組的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)CESCs具有較強(qiáng)的克隆形成能力，擁有多向分化的潛能，所以CESCs具有成為防治DDD和生物組織工程應(yīng)用中新的細(xì)胞資源的可能性。早前的研究提示CEP細(xì)胞能夠定向遷移到NP組織并可以成功轉(zhuǎn)變成為N

4、PCs。假如我們能夠激活CESCs，促使其增殖，調(diào)節(jié)其分化，且維持住CEP的健康形態(tài)，繼而誘導(dǎo)CESCs定向朝NP組織遷移，將會(huì)給DDD的治療帶來(lái)新的途徑。
　　力生長(zhǎng)因子(mechano growth factor，MGF)在1996年被Yang等人發(fā)現(xiàn)。研究顯示MGF屬于類胰島素生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)家族，是其數(shù)個(gè)剪接變異體的其中一個(gè)，在動(dòng)物體內(nèi)被稱為IGF-1Eb

5、，在人體內(nèi)則被命名為IGF-1Ec。多項(xiàng)報(bào)告提示MGF廣泛出現(xiàn)在許多組織，除了能刺激成肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞等力效應(yīng)細(xì)胞出現(xiàn)增殖和遷移的行為以外，此外還能延遲成骨分化行為的發(fā)生，最重要的是還擁有在組織遭受損害時(shí)減少細(xì)胞死亡數(shù)量的作用。其中MGF刺激細(xì)胞增殖和遷移的作用主要與Erk的活化有關(guān)，即其磷酸化水平的增加可導(dǎo)致上述行為的發(fā)生。最近的報(bào)告顯示MGF能夠誘使BMSCs遷移效應(yīng)的發(fā)生?？紤]到CESCs是一類間充質(zhì)來(lái)源細(xì)胞，在細(xì)胞學(xué)特性方面和B

6、MSCs擁有類似的特點(diǎn)，據(jù)此我們猜測(cè)CESCs在MGF的刺激下也許能產(chǎn)生同樣的效應(yīng)。但國(guó)內(nèi)外針對(duì)MGF對(duì)CESCs的效應(yīng)和控制效應(yīng)發(fā)生的機(jī)制的報(bào)道非常少。本課題通過(guò)相應(yīng)的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察CESCs在MGF的刺激下，其增殖、遷移和分化行為發(fā)生的變化，并對(duì)MGF部分效應(yīng)的調(diào)節(jié)途徑也做一定的摸索。
　　研究目的:
　　此課題是依靠臨床手術(shù)收集患者的退變腰椎間盤(pán)CEP組織，使用機(jī)械清除法去除CEP周圍無(wú)用部分，剪碎CEP，用Ⅱ膠原

7、酶消化CEP獲得CEP細(xì)胞。提取得到的CEP細(xì)胞通過(guò)瓊脂糖篩選系統(tǒng)后再體外擴(kuò)增培養(yǎng)，展開(kāi)一系列體外試驗(yàn)，包括鑒定CESCs的干性，觀察CESCs在MGF的刺激下其增殖、遷移和分化的變化。證實(shí)提取的軟骨終板細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，以及MGF對(duì)CESCs細(xì)胞增殖、遷移、分化的影響以及其作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　從臨床上選取多例因腰椎間盤(pán)退變需行椎間盤(pán)融合術(shù)的患者，在患者行融合術(shù)后收集取出的椎間盤(pán)組織，超凈工作臺(tái)下對(duì)標(biāo)本進(jìn)行處理

8、，磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffer，PBS)處理完，標(biāo)本剪成大小不超過(guò)1mm3得碎塊，用1％Ⅱ型膠原酶在37℃下過(guò)夜消化，獲得CEP細(xì)胞后，加入適量完全培養(yǎng)液后放置到培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。采用瓊脂糖篩選系統(tǒng)篩選培養(yǎng)后，使用流式細(xì)胞儀測(cè)定干細(xì)胞標(biāo)志物，進(jìn)行三系誘導(dǎo)分化染色鑒定。選取篩選后生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CESCs，加入不同濃度的MGF溶液，進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用Western blot檢測(cè)Erk磷酸化的表達(dá)。選取篩

9、選后的CESCs細(xì)胞進(jìn)行成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，加入MGF，誘導(dǎo)周期結(jié)束后，使用qPCR測(cè)定成骨、成軟骨相關(guān)基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次以上，拍攝的照片被拿來(lái)做定性分析，數(shù)據(jù)用SPSS20.0軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量數(shù)據(jù)采取平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的方式實(shí)施顯示，兩個(gè)組之間可以使用t檢驗(yàn)進(jìn)行對(duì)比，多組可以采取單因素方差分析進(jìn)行顯示。本次試驗(yàn)設(shè)定P＜0.05是表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異的。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.獲取得CEP細(xì)胞通過(guò)瓊脂糖系統(tǒng)篩

10、選擴(kuò)增后，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)志物以及三系誘導(dǎo)分化的實(shí)驗(yàn)證實(shí)篩選的CEP細(xì)胞擁有干細(xì)胞生物學(xué)特性，為CESCs。
　　2.CESCs增殖實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)CCK-8檢測(cè)，顯示實(shí)驗(yàn)組(MGF組)OD值高于對(duì)照組，其中4.5ng/ml組最顯著(P＜0.05)。并且用Erk拮抗劑PD98059預(yù)先作用CESCs后，MGF的促增殖作用顯著下降(P＜0.05)。Transwell實(shí)驗(yàn)同樣提示實(shí)驗(yàn)組(MGF組)遷移細(xì)胞數(shù)目多于對(duì)照組，其中4.

11、5ng/ml組細(xì)胞數(shù)目最多(P＜0.05)。醋酸溶液洗脫結(jié)晶紫后，用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度，4.5ng/ml組的OD值也是最大的(P＜0.05)。用IGF-1R拮抗劑PQ401預(yù)處理細(xì)胞后，MGF誘使細(xì)胞發(fā)生遷移行為的作用降低(P＜0.05)。Western blot證實(shí)4.5ng/ml時(shí)Erk磷酸化水平顯著增高(P＜0.05)，加入IGF-1R抑制劑PQ401后，Erk磷酸化顯著下降（P＜0.05）。
　　3.CES

12、Cs分化實(shí)驗(yàn)中，特殊染色實(shí)驗(yàn)顯示MGF能抑制CESCs成骨分化，促進(jìn)成軟骨分化;通過(guò)qPCR測(cè)量，成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組(MGF組)CESCs成骨相關(guān)基因表達(dá)降低，說(shuō)明MGF在該濃度水平下抑制CESCs成骨誘導(dǎo)分化。成軟骨分化實(shí)驗(yàn)中，特殊染色實(shí)驗(yàn)顯示MGF促進(jìn)CESCs成軟骨分化;實(shí)驗(yàn)組(MGF組)CESCs成軟骨相關(guān)基因表達(dá)相比對(duì)照組提升了很多，提示MGF在該濃度水平下促進(jìn)了CESCs的成軟骨分化。
　　結(jié)論:
　　1