Sox9基因轉染兔骨髓間充質(zhì)干細胞治療兔退變椎間盤的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 建立兔退變椎間盤的動物模型，應用慢病毒載體介導Sox9基因體外轉染兔MSCs，將其移植入椎間盤內(nèi)，觀察對兔退變椎間盤的影響。
　　 方法：
　　 1.纖維環(huán)穿刺髓核抽吸法建立兔退變椎間盤模型
　　 取健康新西蘭大白兔，術前排除脊柱畸形及退行性病變。麻醉后，取腹膜后外側入路，暴露L3/4、LA/5、L5/6椎間盤，21G針頭刺入椎間隙，深度控制在5mm，反復抽吸至吸出髓核。術前，術后定期行X線

2、和MRI檢查，觀察椎間隙高度指數(shù)及髓核在T2像上的信號變化。12周后處死動物，取材行大體標本觀察，并行病理學觀察、免疫生化檢測Ⅱ型膠原和蛋白多糖表達情況。
　　 2.體外分離培養(yǎng)兔MSCs
　　 取2月齡新西蘭大白兔，體重1.5～2.5kg。麻醉后，無菌操作下抽取骨髓4～6ml(內(nèi)含3000U/ml的肝素0.2ml)，Percoll法分離骨髓單個核細胞，PBS洗滌細胞2次，以2×105/cm2的密度接種于40ml培養(yǎng)瓶。

3、原代培養(yǎng)細胞接近70％～80％融合后，1:3比例進行傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)并拍照。取第3代MSCs，制成單細胞懸液，鑒定。
　　 3.Sox9慢病毒載體轉染MSCs
　　 取第3代生長狀態(tài)良好的MSCs，細胞達到70％～80％融合時，密度為5×105/cm2，加入Sox91慢病毒載體，感染復數(shù)(muhiplicities of infection，MOI)為30，輕輕混勻，置于濕潤的并含有5％CO2

4、培養(yǎng)箱中37℃過夜培養(yǎng)，48小時后熒光顯微鏡觀察綠色熒光的表達并計算轉染率，Western-blot法檢測Sox9蛋白的表達情況。
　　 4.移植Sox9基因修飾后的MSCs，觀察其對兔退變椎間盤的治療作用
　　 退變模型手術后，對照組損傷椎間盤不作任何處理；MSCs組損傷椎間盤移植入濃度為1×106/ml的MSCs，基因轉染組注入Sox9基因修飾過的MSCs，每個椎間隙注入量為20μl。術后定期行X線及MRI檢察，觀察

5、椎間隙高度指數(shù)和髓核T2像信號變化。12周后取材，通過免疫組化檢測Ⅱ型膠原表達情況。分光度法檢測蛋白多糖的含量變化。
　　 結果：
　　 1.實驗組術后4周MRI觀察到髓核信號降低，術后12周發(fā)現(xiàn)椎間隙高度和髓核信號明顯降低，退變明顯。免疫生化結果顯示實驗組Ⅱ型膠原和蛋白多糖含量較對照組明顯減少(P<0.05)。
　　 2.體外分離、培養(yǎng)和傳代的兔MSCs具有增殖快，可重復性強等優(yōu)點，是較理想的組織工程種子細胞之

6、一。
　　 3.Sox9慢病毒載體轉染MSCs后在倒置顯微鏡下細胞呈多角形，胞體增大，生長良好，胞內(nèi)充滿綠色熒光物質(zhì)，轉染率為90％以上。經(jīng)MTT法和流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)轉染對細胞的增殖以及細胞凋亡率無影響。Western-blot檢測結果顯示基因轉染組Sox9蛋白表達明顯高于空白對照組和空慢病毒載體轉染組。
　　 4.術前，術后第4、8、12周行X線及MRI檢查，對照組隨著時間的推移椎間隙高度和髓核信號進行性降低；MSC