Notch-1基因敲除兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞阻止兔椎間盤退行性變的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究小分子干擾RNA(siRNA)靶向沉默兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)中Notch-1基因,并通過(guò)TGF-β1誘導(dǎo)Notch-1基因沉默MSC向髓核樣細(xì)胞定向分化,觀測(cè)Notch-1基因在MSC向類軟骨細(xì)胞定向分化時(shí)的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：(1)4-6周齡新西蘭兔麻醉后,取股骨骨髓,以密度梯度離心法分離培養(yǎng)MSC;(2)根據(jù)siRNA原理針對(duì)Notch-1設(shè)計(jì)短發(fā)卡狀RNA(shRNA),瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入MSC,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

2、(TGF-β1)誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染MSC分化;(3)實(shí)驗(yàn)分組為TGF-β1誘導(dǎo)無(wú)轉(zhuǎn)染組MSC、TGF-β1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染無(wú)意siRNA空質(zhì)粒組MSC、TGF-β1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染siRNA-Notch-1質(zhì)粒組MSC三組,甲苯胺藍(lán)染色及Ⅱ型膠原染色檢測(cè)MSC的細(xì)胞表型的改變情況;(4)RT-PCR及Westernblot法檢測(cè)三組細(xì)胞中Ⅱ型膠原(COL2)及蛋白聚糖(ACAN)基因表達(dá)水平。
　　結(jié)果：(1)光鏡下觀察MSC細(xì)胞形態(tài)主要為梭形或橢圓形,呈

3、巢狀或漩渦狀生長(zhǎng);(2)轉(zhuǎn)染后MSC中Notch-1基因沉默效率為47％(P<0.001),即所選位點(diǎn)具有明顯的沉默效果。(3)甲苯胺藍(lán)染色TGF-β1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染siRNA-Notch-1質(zhì)粒組MSC染色陽(yáng)性表達(dá)明顯高于其余兩組。(4)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TGF-β1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染siRNA-Notch-1質(zhì)粒組MSC的COL2表達(dá)為TGF-β1誘導(dǎo)無(wú)轉(zhuǎn)染組MSC的2.55倍(P<0.001),為TGF-β1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染無(wú)意siRNA空質(zhì)粒組MSC

4、的2.53倍(P<0.001)。ACAN表達(dá)分別為1.51倍(P<0.01)和1.53倍(P<0.01)。Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TGF-β1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染siRNA-Notch-1質(zhì)粒組MSC的COL2表達(dá)為TGF-β1誘導(dǎo)無(wú)轉(zhuǎn)染組MSC的1.25倍(P<0.05),為TGF-β1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染無(wú)意siRNA空質(zhì)粒組MSC的1.37倍(P<0.05)。ACAN表達(dá)分別為1.99倍(P<0.05)和1.46倍(P<0.05)。
　　結(jié)論

5、：(1)使用密度梯度離心法可以分離出純度較高的MSC。(2)三組細(xì)胞經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)均可產(chǎn)生COL2及ACAN,表現(xiàn)出類軟骨細(xì)胞表型;TGF-β1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染siRNA-Notch-1質(zhì)粒MSC表型基因表達(dá)較轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒MSC及未轉(zhuǎn)染MSC顯著提高。
　　目的：使用纖維環(huán)穿刺抽吸法造模兔椎間盤退行性變,移植轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)Notch-1基因沉默兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)到退變的椎間盤內(nèi),觀測(cè)退變椎間盤的變化。<

6、br>　　方法：(1)4只體重0.4-0.5kg新西蘭兔麻醉后,取股骨骨髓,以密度梯度離心法分離培養(yǎng)MSCs;(2)將針對(duì)Notch-1的短發(fā)卡狀RNA(shRNA)及無(wú)意空質(zhì)粒shRNA,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入MSCs,TGF-β1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染MSCs分化;(3)體重1.0-1.5kg新西蘭兔10只,手術(shù)對(duì)兔脊柱L3-4、L4-5、L5-6三個(gè)椎間盤行穿刺抽吸髓核組織造模,2周后行核磁共振成像(MRI)檢查觀測(cè)造模情況;將細(xì)胞分為TGF-β1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染

7、空質(zhì)粒組、TGF-β1誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染shRNA-Notch-1質(zhì)粒組、TGF-β1誘導(dǎo)無(wú)轉(zhuǎn)染組三組細(xì)胞,造模2周后分別移植入L3-4、L4-5、L5-6三個(gè)椎間盤,4周后行MRI檢查觀測(cè)細(xì)胞治療情況;(4)動(dòng)物MRI檢查后處死行髓核組織的甲苯胺藍(lán)染色觀測(cè)蛋白多糖表達(dá)情況,RT-PCR及Western-blot檢測(cè)退變椎間盤組織Ⅱ型膠原(COL2)及蛋白多糖(ACAN)改變情況。
　　結(jié)果：(1)細(xì)胞移植4周后MRI檢測(cè)發(fā)現(xiàn),L4-5椎間

8、盤%T2加權(quán)像掃描(%ST2WI)值增加最為明顯,與其他2組有明顯差異;L3-4、L5-6椎間盤%ST2WI值增加,兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(2)甲苯胺藍(lán)染色:與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比較,實(shí)驗(yàn)組椎間盤組織內(nèi)蛋白多糖的表達(dá)顯著提高。(3)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組椎間盤內(nèi)Ⅱ型膠原及蛋白多糖的表達(dá)明顯高于其余兩組,存在顯著性差異,陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組間無(wú)顯著性差異(4)Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組椎間盤內(nèi)Ⅱ型膠原及蛋白多糖的表達(dá)明