功能化自組裝多肽激活人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及延緩?fù)米甸g盤退變的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究擬進(jìn)一步探究RADKPS的體外及體內(nèi)生物學(xué)作用:
　　第一章 RADKPS體外對人BMSCs趨化遷移的影響
　　目的:
　　通過Transwell小室模型及牛尾椎間盤器官培養(yǎng)模型觀察RADKPS在體外對人BMSCs的趨化遷移的影響。
　　方法:
　　1.委托杭州中肽生化有限公司合成RADA16-Ⅰ及復(fù)合有BMP-7功能片段的RADA-KPSS。將兩種多肽粉末(RADA16-Ⅰ/RADA16-KPSS)

2、以質(zhì)量體積比為10％的蔗糖水充分溶解，得到濃度均為1mg/mL的兩種多肽溶液。將RADA16-Ⅰ與RADA-KPSS以等體積比例混合得到RADKPS溶液。在24孔板的孔中加入400μL/孔無血清培養(yǎng)基(serum free dulbecco's modified eagle medium，SF-DMEM)。再將Transwell小室放置于孔中，分別于每孔中加入100μL體積的RADA16-Ⅰ或者RADKPS溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育30 m

3、in后觀察成膠性能，再通過HE染色觀察水凝膠的組織學(xué)結(jié)構(gòu)。
　　2.通過梯度離心法分離人原代BMSCs，體外擴(kuò)增培養(yǎng)獲取P3代人BMSCs，經(jīng)三系誘導(dǎo)分化（成骨、成脂肪、成軟骨誘導(dǎo)）后，茜素紅染色、油紅O染色及COLⅡ免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定成骨、成脂及成軟骨分化能力，將P3代人BMSCs用SF-DMEM制成細(xì)胞懸液備用。
　　3.利用Transwell小室模型體外探究RADKPS趨化遷移人BMSCs的能力。實(shí)驗(yàn)分為三組:RAD

4、KPS組、RADA16-Ⅰ組、SF-DMEM組，在24孔板的每孔中加入400μL前述三組溶液。然后將P3代人BMSCs用SF-DMEM配制成濃度為1×105/mL細(xì)胞懸液，將100μL此細(xì)胞懸液（共1×104個細(xì)胞）加入到Transwell小室內(nèi)，置于上述24孔板內(nèi)。在培養(yǎng)箱中孵育48 h后，通過結(jié)晶紫染色觀察遷移至Transwell小室濾膜下層細(xì)胞，并統(tǒng)計每視野下(×100)細(xì)胞的數(shù)量。
　　4.利用牛尾椎間盤器官培養(yǎng)模型觀察R

5、ADKPS促進(jìn)人BMSCs從軟骨終板表面向髓核組織趨化遷移的效果。無菌條件下分離牛尾脊柱功能單位，利用磨鉆去除椎體骨而保留軟骨終板。將一側(cè)纖維環(huán)縱向切開，用髓核鉗摘除少量髓核組織，再將50μL體積的RADKPS、RADA16-Ⅰ及SF-DMEM溶液注入髓核缺損處，用縫合線將纖維環(huán)內(nèi)外層縫合，置于6孔板中并在培養(yǎng)箱中預(yù)先孵育24 h。將P3代人BMSCs用PKH26熒光染液標(biāo)記，將標(biāo)記后的細(xì)胞（1×106個）接種至牛尾椎間盤軟骨終板上方。

6、待細(xì)胞“貼壁”后，加完全培養(yǎng)液至沒過椎間盤，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋后，沿著椎間盤冠狀面中央進(jìn)行切片，在熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，計數(shù)髓核組織中帶紅色熒光的細(xì)胞數(shù)量。
　　結(jié)果:
　　RADKPS及RADA16-Ⅰ在體外接觸無血清培養(yǎng)液后均能迅速成膠，同時HE染色觀察提示多肽支架結(jié)構(gòu)均一且紅染。P3代BMSCs經(jīng)成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)后，相應(yīng)的茜素紅、油紅O、COLⅡ免疫細(xì)胞化學(xué)染色均為陽性。體外遷移實(shí)

7、驗(yàn)進(jìn)行48 h后，RADKPS組遷移至小室濾膜下層的細(xì)胞個數(shù)為115.33±11.30，在RADA16-Ⅰ組為20.89±5.49，在SF-DMEM組為8.44±2.65，RADKPS＞RADA16-Ⅰ＞ SF-DMEM組，兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。在牛尾椎間盤器官培養(yǎng)模型中，結(jié)果顯示在冠狀位正中切面上，RADKPS組髓核組織內(nèi)的人BMSCs數(shù)量為41.75±10.81，而在RADA16-Ⅰ與SF-DMEM組分別為16.

8、25±6.13與10.00±4.16，RADKPS組高于其余兩組(P＜0.05)，RADA16-Ⅰ與SF-DMEM組無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　RADKPS及RADA16-Ⅰ在Transwell小室模型中均能促進(jìn)人BMSCs的趨化遷移，且RADKPS的作用要優(yōu)于RADA16-Ⅰ，而在牛尾椎間盤器官培養(yǎng)模型中，僅RADKPS能夠促進(jìn)人BMSCs向椎間盤內(nèi)遷移。
　　第二章 RADKPS對人BMSCs向

9、髓核細(xì)胞分化的影響
　　目的:
　　觀察RADKPS對人BMSCs的活性、增殖及向髓核樣細(xì)胞分化的作用。
　　方法:
　　1.用完全培養(yǎng)基將P3代人BMSCs配成指定密度的細(xì)胞懸液（不同檢測配不同密度），與RADKPS或RADA16-Ⅰ分別以1∶5體積比例混合構(gòu)建細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物。通過FDA/PI染液檢測細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物在培養(yǎng)7天后的活性，同時通過MTT法檢測細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物培養(yǎng)12h、3天及7天時細(xì)胞增殖

10、的情況。
　　2.按照步驟1構(gòu)建細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物，體外培養(yǎng)21天，通過實(shí)時熒光定量PCR檢測髓核細(xì)胞表型SOX-9、COLⅡ、碳酸酐酶-12(carbonic anhydrase-12，CA-12)、角蛋白-19(Keratin-19，KRT-19)、AGG的mRNA相對表達(dá)量。再通過酶聯(lián)免疫分析(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物培養(yǎng)7天，21天時COLⅡ及A

11、GG的含量。
　　結(jié)果:
　　細(xì)胞-水凝膠復(fù)合物在體外培養(yǎng)7天時，RADKPS及RADA16-Ⅰ均使細(xì)胞活性維持在90％左右。MTT法細(xì)胞增殖檢測顯示在體外培養(yǎng)12h及3天時，RADKPS組與RADA16-Ⅰ組細(xì)胞數(shù)量無明顯差異（P＞0.05），第7天時細(xì)胞數(shù)量在RADKPS組多于RADA16-Ⅰ組(P＜0.05）。在體外培養(yǎng)21天時，PCR檢測RADKPS組的人BMSCs表達(dá)SOX-9、COLⅡ、CA-12、KRT-19及

12、AGG的mRNA水平均高于RADA16-Ⅰ組(P＜0.05)。 ELISA檢測提示在體外培養(yǎng)7天時，RADKPS組COLⅡ的含量僅輕度高于RADA16-Ⅰ組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而在體外培養(yǎng)21天時，RADKPS組COLⅡ的含量高于RADA16-Ⅰ組(P＜0.05)。在第7天，21天時，RADKPS組AGG的含量均高于RADA16-Ⅰ組（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　與RADA16-Ⅰ相比，載有BMP-7

13、功能短肽片段的RADKPS在體外能夠維持人BMSCs的活性并促進(jìn)其增殖能力，同時能夠促進(jìn)人BMSCs向髓核細(xì)胞分化。
　　第三章 RADKPS延緩?fù)米甸g盤退變的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:
　　通過動物實(shí)驗(yàn)觀察RADKPS延緩?fù)米甸g盤退變的作用及其在椎間盤內(nèi)募集人BMSCs的作用。
　　方法:
　　1.通過核磁共振檢查（Magnetic Resonance Imaging，MRI）選取椎間盤正常的新西蘭大白兔24只

14、(雌雄不限，體重約2.5-3 kg)。在肌肉注射麻醉及無菌條件下，經(jīng)腹膜后外側(cè)（左側(cè)）入路暴露L2-L5椎體間的3個椎間盤，利用帶21G針頭的10 mL注射器向髓核中央方向穿刺纖維環(huán)至一定深度并在恒定負(fù)壓作用下抽吸出適量髓核組織以誘導(dǎo)椎間盤退變。
　　2.在造模手術(shù)4周后，通過X線檢查及MRI掃描對兔椎間盤退變程度進(jìn)行評估，根據(jù)退變腰椎間盤核磁Pfirrmann分級，選擇椎間盤退變程度在Ⅱ～Ⅲ級的兔子納入后續(xù)治療干預(yù)實(shí)驗(yàn)。將同一兔

15、子的退變椎間盤(L2-L5)及L5-6正常椎間盤分成以下四組:PBS緩沖液(L2-L3)、RADA16-Ⅰ溶液(L3-L4)、RADKPS溶液(L4-L5)，L5-6椎間盤作為正常對照組。在肌肉注射麻醉及無菌條件下，經(jīng)腹膜后外側(cè)（右側(cè)）入路暴露L2-L5節(jié)段間的三個椎間盤，用Hamilton微量注射器（27G針頭）分別往相應(yīng)椎間盤內(nèi)注射20μL的PBS緩沖液、RADA16-Ⅰ溶液、RADKPS溶液。在治療干預(yù)術(shù)后4周，將1 mL密度為1

16、×106/mL的PKH26標(biāo)記人BMSCs細(xì)胞懸液注入耳緣靜脈。
　　結(jié)果:
　　MRI及X線檢查結(jié)果提示，在造模手術(shù)前及造模手術(shù)4周后，L2-3、L3-4、L4-5節(jié)段椎間盤％DHI及RGI在不同節(jié)段間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。在治療干預(yù)手術(shù)后4周及16周，X線檢查提示在不同實(shí)驗(yàn)組間％DHI無差異(P＞0.05)，但均顯著低于正常對照組(P＜0.05)。在治療干預(yù)術(shù)后4周及16周，MRI檢查提示髓核組織RGI在RA

17、DKPS組均要高于RADA16-Ⅰ組及PBS組(P＜0.05)，RADA16-Ⅰ組相對于PBS組無明顯差異(P＞0.05)，三治療干預(yù)組均顯著低于正常對照組(P＜0.05)。在治療干預(yù)16周后，番紅O染色提示，正常對照組髓核組織深染，RADKPS組染色強(qiáng)度強(qiáng)于其余兩干預(yù)組。HE染色提示正常對照組椎間盤髓核及纖維環(huán)界限明顯，仍可見團(tuán)簇樣的巨大細(xì)胞群，在RADKPS組髓核組織與纖維環(huán)組織交界仍存在，保留有較多軟骨樣細(xì)胞，而在RADA16-Ⅰ