腺病毒介導(dǎo)的LacZ基因在脊髓表達(dá)的影響因素.pdf

1、目的：隨著交通事業(yè)及工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，周圍神經(jīng)損傷是臨床上常見(jiàn)的致殘性疾病，而周圍神經(jīng)損傷的治療一直是臨床上棘手的問(wèn)題，目前基因治療的研究已經(jīng)成為周圍損傷研究領(lǐng)域的前沿課題和熱點(diǎn)。其中腺病毒載體(Adenovirus,AdV)在介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染方面已表現(xiàn)出多方面的優(yōu)勢(shì)，使得AdV成為神經(jīng)再生、神經(jīng)示蹤研究及神經(jīng)肌肉疾病基因治療的實(shí)驗(yàn)研究中最具魅力的載體之一。將一些外源性的基因通過(guò)AdV導(dǎo)入神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，通過(guò)導(dǎo)入的外源性基因在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的表達(dá)來(lái)發(fā)揮

2、作用，促進(jìn)周圍神經(jīng)的再生，其中最主要的問(wèn)題是外源性基因在脊髓及周圍神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)情況。本實(shí)驗(yàn)將將攜帶LacZ基因的AdV(AdLacZ)與不帶外源基因的AdO或與攜帶有細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4免疫球蛋白(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4immunoglobulin，CTLA4Ig)基因的AdV(AdCTLA4Ig)通過(guò)微量注射導(dǎo)入大鼠腰膨大脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)，比較共同轉(zhuǎn)染AdCTLA4I

3、g后β-gal在脊髓表達(dá)水平變化：通過(guò)多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)監(jiān)測(cè)腺病毒注入后在脊髓的消失時(shí)間和采用病毒液10倍系列稀釋提取DNA檢測(cè)出腺病毒的特異性條帶的最低稀釋度及逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)比較CTLA4Ig基因和LacZ基因在大鼠脊髓的表達(dá)，并用流式細(xì)胞儀來(lái)測(cè)定血中淋巴細(xì)胞亞群的變化，以探討CTLA4Ig誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)AdLacZ的免疫耐受的作用及其機(jī)理，觀察腺病毒在脊髓表達(dá)的影響因素。 方法：選用7周齡健康雌性W

4、ister大鼠200只，體重200～250g。將大鼠隨機(jī)分成兩組，每組100只。對(duì)照組(A組)導(dǎo)入AdlacZ+AdO，實(shí)驗(yàn)組(B組)導(dǎo)入AdlacZ+AdCTLA4Ig。將大鼠經(jīng)腹腔注射氯胺酮/塞拉嗪麻醉(75-100mg/kg+5mg/kg)，麻醉成功后固定于腦立體定位儀上。取長(zhǎng)約2cm后正中切口，去除T13椎板暴露脊髓腰膨大部位。利用微量注射器及ST-Ⅲ型手動(dòng)推進(jìn)器，于脊髓后正中動(dòng)脈右側(cè)0.8mm處注射AdlacZ(1×109pf

5、u/ml)和AdO(5×109pfu/ml)各1μl(A組)或AdLacZ(1×109 pfu/ml)和AdCTLA4Ig(5×109pfu/ml)各1μl(B組)。針尖向頭側(cè)呈45度斜行進(jìn)針，斜行刺入深度為2.5mm。注射速度為1μl/min，注射完畢后滯針5min，緩慢拔針。充分止血、沖洗傷口，局部噴灑抗生素預(yù)防感染，關(guān)閉傷口。兩組在轉(zhuǎn)染病毒后10個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)鼠尾靜脈取血2ml；在轉(zhuǎn)染后10個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)兩組動(dòng)物脊髓進(jìn)行厚50μ

6、m的連續(xù)冰凍橫切片，計(jì)數(shù)A組與B組中X-gal染色陽(yáng)性的切片數(shù)，分析比較兩組LacZ基因在脊髓表達(dá)的高峰期和持續(xù)時(shí)間；多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)監(jiān)測(cè)腺病毒注入后在脊髓的消失時(shí)間采用病毒液10倍系列稀釋提取DNA檢測(cè)出腺病毒的靈敏度及逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)CTLA4Ig基因和LacZ基因在大鼠脊髓的表達(dá)，并用流式細(xì)胞儀來(lái)測(cè)定血中淋巴細(xì)胞亞群CD4和CD8的變化。 結(jié)果： 1.X-gal，CTL,A4Ig轉(zhuǎn)基因

7、表達(dá)：LacZ基因和CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染脊髓雙側(cè)的前角運(yùn)動(dòng)細(xì)胞和周圍的膠質(zhì)細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因表達(dá)范圍局限于注射點(diǎn)上下各0.6cm區(qū)段，有轉(zhuǎn)基因表達(dá)的陽(yáng)性冰凍橫切片數(shù)≤240片。轉(zhuǎn)基因神經(jīng)元在注射同側(cè)表達(dá)較對(duì)側(cè)強(qiáng)烈。切片觀察可見(jiàn)A組的X-gal染色陽(yáng)性表達(dá)時(shí)間約為2周；而B(niǎo)組的X-gal染色陽(yáng)性表達(dá)時(shí)間約為4周。脊髓陽(yáng)性切片計(jì)數(shù)顯示兩組β-gal在脊髓表達(dá)的高峰期均在2～8天，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明兩組之間在高峰期間陽(yáng)性切片數(shù)無(wú)顯著差異(P＞0.05

8、)。 2 PCR檢測(cè)2.1腺病毒液PCR檢測(cè)：腺病毒的表達(dá)量隨著濃度的降低而逐漸減小。采用病毒液10倍系列稀釋提取后DNA經(jīng)PCR反應(yīng)可檢測(cè)出腺病毒的特異性條帶的最低稀釋度為10-4。AdlacZ(1×109pfu/ml)與AdO(5×109 pfu/ml)特異性條帶的最低稀釋度一致。 2.2脊髓標(biāo)本腺病毒PCR檢測(cè)：用PCR法從DNA水平分別檢測(cè)腺病毒在對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)情況，腺病毒的DNA量是隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降的，直至第1

9、0周檢測(cè)不到腺病毒的表達(dá)。 3：RT-PCR檢測(cè)：轉(zhuǎn)染后均可見(jiàn)β-gal和CTLA4IgmRNA的表達(dá)。B組β-gal表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)于A組。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明兩組之間β-gal表達(dá)量無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 3.1 β-galmRNA在大鼠脊髓組織的表達(dá)：用RT-PCR.法從mRNA水平分別檢測(cè)β-gal在對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)情況：轉(zhuǎn)染1天后兩組均可檢測(cè)出βgalmRNA在大鼠脊髓組織的表達(dá)，對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組表達(dá)上調(diào)高峰均為術(shù)后

10、3天，高表達(dá)量可以持續(xù)到3周，對(duì)照組到第8周完全消失。實(shí)驗(yàn)組到第9周完全消失。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明兩組之間在高峰期間細(xì)胞表達(dá)數(shù)無(wú)顯著差異(P＞0.05)，組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)比較細(xì)胞表達(dá)數(shù)有顯著差異(P＜0.05)。 3.2 CTLA4IgmRNA在大鼠脊髓組織的表達(dá)：用RT-PCR法從mRNA水平分別檢測(cè)CTLA4IgmRNA在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染一天后實(shí)驗(yàn)組可檢測(cè)出CTLA4IgmRNA在大鼠脊髓組織的表達(dá)，表達(dá)上調(diào)高峰為術(shù)后3-5天，高表達(dá)

11、量可以持續(xù)到3周，到第9周完全消失。 4 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)：流式細(xì)胞儀分析顯示，兩組轉(zhuǎn)染后1天血中CD4、CD8淋巴細(xì)胞開(kāi)始升高，2天CD8淋巴細(xì)胞顯著升高，而CD4淋巴細(xì)胞則在轉(zhuǎn)染后第6天開(kāi)始顯著升高，兩種細(xì)胞直至9天左右達(dá)到高峰，兩周后CD4淋巴細(xì)胞保持在一個(gè)穩(wěn)定的水平，CD8淋巴細(xì)胞隨著時(shí)間數(shù)量逐漸減少。實(shí)驗(yàn)組CD4、CD8淋巴細(xì)胞數(shù)值均小于對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明兩組之間在高峰期間細(xì)胞表達(dá)數(shù)無(wú)顯著差異(P＞0.05)，組內(nèi)不