腺病毒介導人HCN4基因在大鼠骨髓間充質干細胞表達的研究.pdf

1、竇房結是心臟原始的生物“起搏器”，因某些原因生物“起搏器”會失去原有的功能而導致竇性心動過緩、竇性停搏等心律失?！，F(xiàn)有的人工心臟起搏器是治療緩慢性心律失常的有效方法。但由于人工起搏器存在著種種缺點，就心臟生理功能和人體適應性而言，生物心臟起搏無疑是更理想的。目前生物心臟起搏研究尚處于細胞及動物實驗階段，如何構建以及其穩(wěn)定性、持續(xù)時間和副反應等因素仍未明確，有必要作進一步探討。
　　 作為目前最受關注的生物起搏備選基因，與其他離子

2、通道基因比較，超極化激活及環(huán)化核苷酸門控陽離子通道基因(hyperpolarization-activated cyclicnucleotide-gated cation channel，HCN)具有其獨特的優(yōu)勢：只參與動作電位4相自動除極化的形成，對動作電位的復極過程并無影響，理論上可以降低誘發(fā)新的心律失常的風險；其次HCN通道功能主要受細胞內(nèi)cAMP水平調控，因此以HCN基因構建的生物起搏器能夠接受自主神經(jīng)系統(tǒng)的調節(jié)，使起搏頻率適應

3、機體生理活動的需要。
　　 HCN基因編碼If離子流(funny current)。在脊椎動物，HCN家族包含4個成員即HCN1-4，HCN3似乎僅在神經(jīng)元特定表達，其他三種(HCN1，2和4)則在神經(jīng)中樞、心臟及其他外周組織均可檢測到。HCN通道具有獨特的特性，包括超極化激活、鈉鉀離子通透、細胞內(nèi)cAMP調節(jié)及微弱的單通道電導等被認為是起搏活動所必須的獨特特征。
　　 一系列實驗結果證實在心肌細胞或心臟傳導系統(tǒng)過度表達

4、HCN基因可產(chǎn)生類似生物起搏器的效應。由于目前所研究的動物竇房結中，HCN4含量最豐富；HCN4對于心臟傳導系統(tǒng)的正常發(fā)育也起著至關重要的作用；目前為止與人類HCN基因變異有關的報道均局限在HCN4基因，且都與心律失常的產(chǎn)生有關；在HCN基因4種亞型中，HCN4對自主神經(jīng)張力變化的反應是最強的?；谏鲜鲈?，本研究設想HCN4可能是更為合適的構建生物起搏器的備選基因。
　　 綜上所述，HCN4是調控If電流及維持竇房結起搏細胞電

5、生理功能的特異性基因，是一種理想的生物起搏靶基因；骨髓間充質干細胞(MSCs)不僅具有多向分化潛能，且易于整合外源基因、免疫源性低，是生物起搏研究中比較理想的基因運載細胞；同時腺病毒載體具有病毒滴度高、容量大、轉導效率高、感染范圍廣以及穩(wěn)定性好等優(yōu)點：而目前國內(nèi)外尚無通過腺病毒載體將HCN4基因轉導入MSCs重建生物起搏點的報道。本實驗擬通過腺病毒介導人HCN4基因在大鼠MSCs結構及功能的表達，觀察MSCs能否表達相應的起搏通道基因、

6、蛋白質及If電流，為生物心臟起搏治療尋找合適的靶基因及種子細胞。
　　 第1章大鼠骨髓間充質干細胞體外分離培養(yǎng)及成脂、成骨誘導分化
　　 骨髓間充質干細胞(MSCs)在骨髓中的數(shù)量極少，骨髓的有核細胞中大約每10萬個有核細胞才含有1個MSCs，選擇一個有效、操作簡單方便的體外分離、純化方法在MSCs研究中顯得尤為重要。本文旨在原有研究的基礎上，探討MSCs體外分離、純化培養(yǎng)方法以及應用成骨、成脂誘導分化進行鑒定。

7、　　 研究目的:
　　 建立大鼠MSCs體外分離培養(yǎng)方法，研究MSCs生物學特性，為下一步建立生物心臟起搏點奠定基礎。
　　 材料和方法:
　　 健康SD雄性大鼠，體重100g左右，無菌條件下抽取骨髓，采取貼壁分離和消化控制相結合的培養(yǎng)方法分離純化MSCs，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，測定細胞生長曲線，采用流式細胞儀檢測細胞表面抗原CD34、CD90、CD44、CD106、CD45及CD11b表達，以及應用成骨、

8、成脂誘導分化進行鑒定。
　　 結果:
　　 MSCs生長性狀相對穩(wěn)定，細胞生長曲線顯示P1、P3、P5代細胞生長情況基本相同，培養(yǎng)至P3代細胞形態(tài)已較一致，呈均一的成纖維細胞樣；采用流式細胞儀檢測結果顯示P4代細胞CD90和CD44陽性率均在90％以上，CD34、CD45和CD11b陽性率均小于2％；分別應用成骨、成脂誘導劑誘導分化并鑒定，顯示所培養(yǎng)的細胞為較高純度的MSCs。
　　 小結:
　　 1采取

9、貼壁分離和消化控制相結合的培養(yǎng)方法可以得到較高純度的MSCs，同時具有操作簡單方便、損傷小的特點，是比較理想的MSCs分離純化方法。
　　 2大鼠MSCs生長性狀相對穩(wěn)定，體外培養(yǎng)具有很強的擴增能力，同時可向成骨細胞及脂肪細胞分化，提示體外培養(yǎng)MSCs可以滿足組織工程和細胞治療的需要。
　　 第2章人HCN4基因重組腺病毒載體的構建
　　 近年來，分子生物學領域取得了迅猛發(fā)展，特別是重組DNA技術的建立，使得各種

10、病毒用作載體成為可能。其中，腺病毒載體是繼逆轉錄病毒載體后在基因治療、基因免疫等方面應用開發(fā)得較早的一種基因載體，目前已成為基因治療的研究熱點。
　　 研究目的:
　　 本實驗擬應用經(jīng)改良優(yōu)化后的pShuttle-CMV穿梭質粒和pAdxsi腺病毒骨架質粒，以體外連接的方法構建重組腺病毒AdHCN4，為構建心臟生物起搏點作準備。
　　 材料和方法:
　　 將pShuttle-GFP-CMV重組穿梭載體用H

11、ind III、Avr II雙酶切，pCDNA3.1-HCN4用Hind III、Xba I雙酶切，T4 DNA連接酶進行連接，構建重組穿梭質粒pShuttle-HCN4；I-CeuI、I-Scel雙酶切處理pAdxsi載體，I-Ceu I、I-SceI雙酶切處理重組穿梭質粒pShuttle-HCN4，同樣以T4 DNA連接酶進行連接，重組腺病毒質粒pAdxsi-HCN4構建完成：采用脂質體介導法用線性化pAdxsi-HCN4轉染293

12、細胞，從病變的293細胞分離、純化重組腺病毒AdHCN4。
　　 結果:
　　 重組穿梭質粒pShuttle-HCN4以Hind III和Xho I雙酶切，并采用DNA基因序列測定證實構建成功；重組腺病毒質粒pAdxsi-HCN4用Xho I酶切鑒定證實構建成功；重組腺病毒Ad-HCN4經(jīng)PCR鑒定證實構建成功，OD260/OD280為1.29，病毒滴度為2.5×1011pfu/ml。
　　 小結:
　　

13、 1采用經(jīng)改良優(yōu)化后的pShuttle-CMV穿梭質粒和pAdxsi腺病毒骨架質粒，以體外連接的方法構建重組腺病毒，提高了重組效率，使非特異性重組率降低。
　　 2重組腺病毒Ad-HCN4經(jīng)PCR鑒定證實攜帶目的基因HCN4，重組腺病毒構建成功。
　　 3重組腺病毒Ad-HCN4經(jīng)293細胞大量擴增，氯化銫梯度離心純化，獲得的病毒滴度為2.5×1011pfu/ml，為下一步實驗提供了保證。
　　 第3章腺病毒介導

14、人HCN4基因在大鼠骨髓間充質干細胞結構和功能的表達
　　 相對于電子起搏器，生物起搏器可使緩慢性心律失常患者獲得更大的益處。近來的研究表明，基因治療和干細胞移植可重建生物心臟起搏點。其中一個重要的途徑是將骨髓間充質干細胞作為移植平臺，裝載基因以建立生物起搏器。如果干細胞裝載并表達起搏基因HCN4，和周圍細胞形成充分的縫隙連接，則干細胞能在4相形成內(nèi)向If電流，自動除極化而形成自律性起搏點，該電流通過縫隙連接傳播到相鄰心肌細胞與

15、整個傳導系統(tǒng)和心肌組織，從而重建生物心臟起搏點。本實驗擬為構建生物心臟起搏點進行初步探討。
　　 研究目的:
　　 通過重組腺病毒AdHCN4感染大鼠MSCs，檢測轉染目的基因的MSCs能否表達HCN4 mRNA、蛋白質及If電流，為構建生物心臟起搏點進行初步探討。
　　 材料和方法:
　　 重組腺病毒AdHCN4感染大鼠MSCs，經(jīng)熒光顯微鏡人工計數(shù)及流式細胞儀檢測轉染效率；應用RT-PCR方法檢測轉染

16、目的基因的MSCs能否表達HCN4mRNA、應用細胞免疫熒光及western blot檢測轉染目的基因的MSCs能否表達HCN4蛋白質；膜片鉗全細胞記錄模式記錄轉染目的基因的MSCs能否表達If電流。
　　 結果:
　　 1重組腺病毒AdHCN4感染大鼠MSCs，經(jīng)熒光顯微鏡人工計數(shù)及流式細胞儀檢測，最佳MOI值為800，最高轉染效率為90.23±4.30％。
　　 2重組腺病毒AdHCN4感染大鼠MSCs后可檢

17、測到MSCs表達HCN4 mRNA及蛋白質，膜片鉗實驗證實有If電流的表達。
　　 小結:
　　 重組腺病毒AdHCN4感染大鼠MSCs后可使MSCs表達HCN4 mRNA及蛋白質，膜片鉗實驗證實有If電流的表達，提示HCN4及MSCs可作為生物心臟起搏治療合適的靶基因及種子細胞。
　　 全文結論:
　　 1采取貼壁分離和消化控制相結合的培養(yǎng)方法可以得到較高純度的MSCs，同時具有操作簡單方便、損傷小的特

18、點，是比較理想的MSCs分離純化方法，體外培養(yǎng)MSCs可以滿足組織工程和細胞治療的需要。
　　 2采用經(jīng)改良優(yōu)化后的pShuttle-CMV穿梭質粒和pAdxsi腺病毒骨架質粒，以體外連接的方法構建重組腺病毒，經(jīng)PCR鑒定證實構建成功。
　　 3重組腺病毒Ad-HCN4經(jīng)293細胞大量擴增，氯化銫梯度離心純化，獲得的病毒滴度為2.5×1011pfu/ml，為靶基因感染大鼠MSCs提供了保證。
　　 4重組腺病毒A