人起搏通道HCN2基因在大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的表達及其意義.pdf

1、目的： 研究新生大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)離子流的特點及起搏通道基因的表達；探討MSCs轉(zhuǎn)染人超極化激活的環(huán)化核苷酸門控通道(hyperpolarization-activated cyclic-nucleotide gated，HCN)亞型2后起搏電流的特點及與新生大鼠心室肌細胞共培養(yǎng)后對心室肌細胞收縮頻率的影響。 方法： 1．分離、培養(yǎng)及純化新生大鼠MSCs

2、；并用流式細胞儀鑒定。 2．通過實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chainreaction，Real-time PCR)方法，檢測新生大鼠MSCs HCN基因的表達。 3．通過全細胞膜片鉗技術(shù)，記錄2～3代未分化的新生大鼠MSCs的電流并研究其特點。 4．用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將重組有編碼起搏電流基因的質(zhì)粒pcDNA3-hHCN2導(dǎo)入新生大鼠MSCs中，用全

3、細胞膜片鉗技術(shù)記錄起搏電流(I<,hHcN2>)；用Real-time PCR和Westem印跡檢測目的基因hHCN2的mRNA和蛋白表達。 5.分離、培養(yǎng)及純化新生大鼠心室肌細胞，并通過光鏡、透射電鏡和免疫組化鑒定心室肌細胞；把培養(yǎng)的新生大鼠心室肌細胞和轉(zhuǎn)染人HCN2通道的MSCs共培養(yǎng)，觀察新生大鼠心室肌細胞收縮頻率的改變。 結(jié)果： 1．新生大鼠MSCs表達CD90，其陽性率達(97.5±1.5)％，幾乎不表

4、達CD45、CD44和CD31：這表明MSCs是骨髓中區(qū)別于造血干細胞的一群處于未分化狀態(tài)的非定向干細胞。 2．新生大鼠MSCs起搏通道基因HCN1、HCN2、HCN3和HCN4在總HCN的表達中所占比例分別為(0.08±0.01)％、(77.16±0.03)％、(0.24±0.01)％和(22.53±0.02)％?？梢娦律笫驧SCs起搏通道基因的表達以HCN2和HCN4為主。 3.在未分化的新生大鼠MSCs中檢測到多

5、種離子流，包括內(nèi)向整流性鉀流(I<,kir>)、瞬時外向性鉀流(I<,to>)、延遲整流性鉀流(IK<,DR>)、鈣激活性鉀流(I<,Kca>)和鈉離子流(I<,Na>)，但沒有記錄到起搏電流(I<,f>)。 4．全細胞膜片鉗技術(shù)記錄到I<,hHCN2>，得到電流密度．電壓曲線，其激活電壓約為-75mV,此電流可以被4mmol/L CsCl阻斷，也可以被100μmol/L ZD7288(I<,f>特異性阻斷劑)阻斷。 R

6、eal-time PCR檢測有hHCN2 mRNA高表達，Western印跡檢測有hHCN2蛋白表達。 5．心室肌細胞與轉(zhuǎn)染人HCN2通道的MSCs共培養(yǎng)后，在共培養(yǎng)前和共培養(yǎng)后的第1天，三組(空白對照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3組、轉(zhuǎn)染hHCN2/pcDNA3實驗組)沒有顯著性差異(P>0.05)。而共培養(yǎng)后的第2和第3天，轉(zhuǎn)染hHCN2/pcDNA3實驗組的心室肌細胞收縮頻率明顯比空白對照組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3組快(P<0

7、.05)。 結(jié)論： 1．新生大鼠MSCs的起搏通道基因表達以HCN2和HCN4為主；HCN1、HCN2、HCN3和HCN4在總HCN的表達中所占比例分別為(0.08±0.01)％、(77.16±0.03)％、(0.24±0.01)％和(22.53±0.02)％。 2．未分化的新生大鼠MSCs存在五種功能性離子流，包括4種外向電流(I<,kir>、I<,to>、IK<,DR>和I<,Kca>)和1種內(nèi)向電流(I<,