RNAi對誘導(dǎo)分化后大鼠間充質(zhì)干細(xì)胞MHCII基因表達(dá)的抑制及其意義的研究.pdf

1、目的：
　　體外5-aza誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化后，構(gòu)建用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干細(xì)胞的CIITA－RNAi慢病毒載體，探討RNA干擾CIITA的抑制效果以及對MHCII基因表達(dá)的下調(diào)作用，從而篩選出沉默效率最佳的載體；通過淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)評(píng)估基因修飾后干細(xì)胞的免疫原性，初步探討MHCII基因在同種異體移植中的免疫排斥作用，為移植后干細(xì)胞能否長期存活而有效改善心功能提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1．全骨髓貼壁法

2、體外分離、培養(yǎng)、純化 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Mesenchymal Stem Cells，BMSCs），當(dāng)細(xì)胞達(dá)80-90％融合時(shí)，用胰酶-EDTA(0.25％：0.05％)消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀細(xì)胞表面標(biāo)記檢測鑒定。
　　2．取第3代細(xì)胞，用10umol/L的5-氮雜胞苷誘導(dǎo)BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化，采用MTT法檢測細(xì)胞的生長情況；
　　3．誘導(dǎo)2W后，采用RT-QPCR檢測心

3、肌發(fā)育相關(guān)基因NKx2.5，心肌結(jié)構(gòu)相關(guān)基因β-mhc的mRNA表達(dá)水平，并用免疫熒光法檢測肌鈣蛋白（CTnT）的表達(dá)情況。
　　4．根據(jù)CIITA基因信息，設(shè)計(jì)3對小干擾序列及1對陰性對照（NC)序列，將靶向CIITA的shRNA表達(dá)序列連接到慢病毒載體GV118-GFP中，獲得
　　GV118-GFP-shCIITA重組質(zhì)粒，測序鑒定正確后與慢病毒包裝質(zhì)粒 pHelper1.0及pHelper2.0通過Lipofecta

4、mine2000共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞293T，包裝產(chǎn)生病毒液，逐孔稀釋法測定病毒滴度。
　　5．包裝好的GV118-GFP-NC Lentivirus以MOI0、1、10、100感染誘導(dǎo)分化后的 BMSCs，分別在感染后12h，24h，48h，72h后用.熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)（488 nm波長）檢測感染效率，篩選出獲得最佳感染效率的MOI值及時(shí)間。
　　6．包裝好的4組病毒以最佳MOI值感染dBMSCs，72h

5、后收集細(xì)胞，RT-QPCR檢測各組免疫原性相關(guān)基因CIITA、MHCIImRNA的表達(dá)情況；Western Blot檢測各組MHCII表達(dá)情況，篩選出MHCII基因沉默效率最佳的一組病毒。
　　7．通過淋巴增殖實(shí)驗(yàn)來檢測基因修飾后的干細(xì)胞能否觸發(fā)異體免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)。
　　8．?dāng)?shù)據(jù)分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6、　　結(jié)果：
　　1.原代及傳代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均呈成纖維細(xì)胞樣的長梭形，第3代BMSCs低表達(dá)造血標(biāo)志CD34(0.64％)、CD45(0.35％)，強(qiáng)表達(dá)CD29(99.86％)，CD44(99.47％)，CD90（98.97％）等基質(zhì)細(xì)胞/間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志。
　　2．5-氮雜胞苷誘導(dǎo)2W后，細(xì)胞形態(tài)各異，呈梭形、不規(guī)則形，體積開始變大，部分視野可見肌管樣結(jié)構(gòu)。MTT法檢測結(jié)果表明，誘導(dǎo)組和對照組的生長情況無顯著性差異，

7、P＞0.05。
　　3. RT-QPCR結(jié)果表明，誘導(dǎo)組所檢測的Nkx2.5及MHC mRNA的表達(dá)量均顯著高于對照組，P值<0.05，分別是對照組的6.5倍、36.2倍；免疫熒光檢測結(jié)果：誘導(dǎo)組心肌特異性肌鈣蛋白I（CTnI）呈陽性表達(dá)，心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為18%左右。而對照組呈弱陽性或陰性。
　　4．核苷酸序列檢測結(jié)果表明，siRNA表達(dá)模板成功構(gòu)建于GV118-EGFP載體上，序列與目的序列相同。3質(zhì)粒包裝系統(tǒng)產(chǎn)生的病毒分

8、別命名為LV-CIITA-shRNA1、LV-CIITA-shRNA2、LV-CIITA-shRNA3、LV-NC-shRNA；逐孔稀釋法測定病毒液的滴度分別為8×108TU/ml、5×108TU/ml、6×108TU/ml、1×109TU/ml。
　　5．GV118-GFP-NC Lentivirus感染BMSCs48h后可觀測到EGFP表達(dá)，72h達(dá)到高峰；MOI為1~10時(shí)，感染效率不足50%；MOI為100時(shí)，細(xì)胞生長狀態(tài)

9、良好，與正常對照組細(xì)胞形態(tài)無明顯差異，感染效率達(dá)80%以上，流式細(xì)胞儀測得EGFP陽性標(biāo)記率為83.7%。
　　6．CIITA和MHCII mRNA在各組樣本均有表達(dá)，BMSCs組顯著低于dBMSCs組，P值<0.01；各干擾病毒感染組的表達(dá)量均顯著低于正常對照和陰性對照組，其中LV-CIITA-shRNA3組最為明顯；dBMSCs組CIITA mRNA的表達(dá)量分別為干擾組的4.7倍、3.9倍、6.9倍，MHCII mRNA的表達(dá)

10、量分別為干擾組的4.6倍、3.5倍、5.2倍。Western Blot檢測與PCR結(jié)果吻合，正常對照組MHCII蛋白的表達(dá)量分別為干擾組的1.74倍、1.61倍、1.85倍；抑制效率分別為43%、38%、46%。
　　7．混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果表明，未誘導(dǎo)組及基因修飾組的抑制率顯著高于誘導(dǎo)組，P＜0.05。
　　結(jié)論：
　　1.在5-氮雜胞苷的作用下成功誘導(dǎo)BMSCs向心肌樣細(xì)胞分化。
　　2.成功構(gòu)建了大鼠CII