大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和彈性軟骨細(xì)胞基因差異表達(dá)分析.pdf

1、目的：本試驗(yàn)應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩選大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及彈性軟骨的差異表達(dá)基因，由此尋找刺激差異基因表達(dá)的生物因子以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向彈性軟骨分化以得到組織工程化軟骨。 方法： (1)通過密度梯度離心法和貼壁篩選法的聯(lián)合應(yīng)用提取SD大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，酶消化法得到耳部彈性軟骨細(xì)胞，分別于加入10﹪FCS的DMEM和DMEM/F12培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)。 (2)取培養(yǎng)2—3代后的細(xì)胞用一步法提取兩種細(xì)胞的RN

2、A并純化，將兩者RNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈CDNA，用Cy5-dCTP，Cy3-dCTP分別標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的CDNA探針，雜交并嚴(yán)格清洗，用LuxScan10KA雙通道激光掃描儀進(jìn)行掃描熒光信號圖像，每點(diǎn)上兩種熒光信號的強(qiáng)度分別代表Cy5-dCTP和Cy3-dCTP的量，獲得的熒光信號圖像用計(jì)算機(jī)GenePix Pro 4.0圖像分析軟件進(jìn)行分析。 結(jié)果： (1)軟骨細(xì)胞和MSCs樣品RNA吸光度A260/A28

3、0比值>1.79；軟骨細(xì)胞總RNA量為79.2μg，MSCs總RNA量為22.5μg。兩種細(xì)胞RNA電泳條帶清晰，28S比18S rRNA條帶亮度接近2：1． (2)按差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，cy5/cy3<0.5為表達(dá)上調(diào)基因，cy5/cy3>2為表達(dá)下調(diào)基因，從28800條基因中篩選出差異表達(dá)基因2114條。以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為對照，在軟骨中有1226條基因上調(diào)，888條基因下調(diào)。由于差異基因數(shù)量較多，我們重點(diǎn)研究了差別在20倍以上

4、的基因，即cy5/cy3<0.05或者cy5/cy3>20的基因，我們將其定義為顯著差別基因。 (3)在顯著差別基因中，包括細(xì)胞骨架和運(yùn)動蛋白相關(guān)基因，細(xì)胞周期蛋白相關(guān)基因，免疫相關(guān)基因，細(xì)胞信號和傳遞蛋白相關(guān)基因，細(xì)胞外基質(zhì)類基因，轉(zhuǎn)錄因子類基因，蛋白翻譯和合成相關(guān)基因、代謝相關(guān)基因等。我們發(fā)現(xiàn)了兩種生長因子在軟骨中高表達(dá)：軟骨調(diào)節(jié)素和結(jié)締組織因子。細(xì)胞外基質(zhì)中軟骨相關(guān)基因，例如Ⅱ型膠原和彈性膠原在軟骨中高表達(dá)，而在骨髓間充質(zhì)

5、干細(xì)胞中高表達(dá)基因的多是酶類，證明了其幼稚性，有向多種組織分化的能力。 結(jié)論： (1) 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的基因表達(dá)譜存在顯著差異。 (2) 誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化可能是多種因子的協(xié)同作用，上調(diào)或者下調(diào)某些關(guān)鍵基因的表達(dá)的結(jié)果。 (3) 本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以軟骨調(diào)節(jié)素和結(jié)締組織因子為代表的1 226條基因在軟骨中高表達(dá)，可能與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化有關(guān)。 (4) 本試驗(yàn)骨髓還發(fā)現(xiàn)以基質(zhì)