lewis大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)和鑒定

1、3 6 0福 建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 2 0 0 5 年 1 O月 第 3 9卷第 4期 L e wi s大鼠 骨 髓 間充 質(zhì) 千 細(xì) 胞分 離 培 養(yǎng)和 鑒 定 鄭輝 哲 ，林 群 ，雷立 華 ，楊 進(jìn) ，韓 濤 摘要：目的 建 立從 L e w i s 大 鼠骨髓 中分離 、 培養(yǎng) 間充質(zhì)干細(xì)胞 的方 法， 并對分 離、 培 養(yǎng)的 間充質(zhì)干細(xì) 胞進(jìn) 行鑒定。方法 采用 P e r c o 1 1 ( 1 ． 0 7 3g ／ L

2、) 密度梯度分離和貼壁培 養(yǎng)相結(jié)合 的方法 分離 培養(yǎng) L e w i s 大 鼠 的骨 髓間 充質(zhì)干細(xì)胞 ( MS C ) 。M S C細(xì)胞鑒定 ： 采用相差顯微鏡觀察 M S C的形態(tài)學(xué)特 征 ； 流式細(xì)胞儀 檢測細(xì)胞表面標(biāo)志抗原 C D 2 9 ， C D g 0 ， c D 3 4 和 C D 4 5 的表達(dá) 率 ； 蘇丹 Ⅳ染色 檢測 MS C成脂 細(xì)胞分化 ； 堿性 磷酸酶 染色 和茜 素紅染 色檢測 MS C成骨分化。結(jié)果

3、 原代培養(yǎng) 的 MS C于 2 4h后貼壁 ， 4 8 ～7 2h形成集落， 1 2 ～1 5d 可 達(dá)到 8 O ％～9 O ％融合 。第 1代細(xì)胞表面標(biāo)記物 C D 2 9 ， c D 9 0 ， C D 3 4 和 C D 4 5 的陽性率分 別為 8 O ． 4 1 ％， 6 6 ． 2 7 ％， 2 ． 7 3 ％， 0 ． 7 4 ％。第 3 代 細(xì)胞表面 標(biāo)記物 c D 2 9 ， c D 9 0 ， C I ： h 4

4、和 C D 4 5 的陽性率分別 為 8 9 ． 9 1 ％， 8 8 ． 1 7 ％， 0 ． 8 1 ％， 0 ． 1 7 ％。細(xì)胞周期 分析顯示 ， 第 5 代 細(xì)胞 G 0 ／ G l 期細(xì)胞占 6 8 ． 9 ％， S + G 2 + M 期 為 3 1 ． 1 ％。用 a — ME M培養(yǎng) 液培養(yǎng) 的第 6 代 細(xì)胞部 分分化 為成骨和成脂 細(xì)胞。結(jié)論 采 用 P e r c o l l ( 1 ． 0 7 3g ／ L )

5、 密度 梯 度分 離 和貼 壁培 養(yǎng) 相 結(jié)合 的方 法 能夠 成 功 分離 和 培養(yǎng) 大 鼠的 MS C 。第 5代 MS C細(xì)胞保 持分化潛能 。關(guān)鍵詞 ： 大 鼠，近交 L e w；細(xì)胞分離 ；細(xì)胞培養(yǎng) ； 干細(xì)胞 ；骨髓細(xì)胞 ； 細(xì)胞周期 ； 細(xì)胞分化 中圖分類號 ： R 3 2 9 ． 2文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ： A文章 編號 ： 1 6 7 2 — 4 1 9 4 ( 2 0 0 5 ) 0 4 — 0 3 6 0 — 0 4骨 髓

6、間 充質(zhì) 干 細(xì) 胞 ( MS C) 移 植 治 療 心肌 梗 死 的研究常選用近交系 L e w i s 大 鼠為實驗對象， 以減 少異體移植排斥反應(yīng)和建立穩(wěn)定 的心肌梗死模型。筆者擬從近交系 L e w i s 大鼠的骨髓分離 、 培養(yǎng)、 擴(kuò)增 MS C ， 流式細(xì)胞儀檢測表面標(biāo) 記物， 并促進(jìn)其 向成 骨及成脂細(xì)胞分 化來獲得 進(jìn)一步證 實， 了解 MS C的增殖特性， 為后續(xù)的 MS C移植 治療心肌梗死 的 研究 奠定基 礎(chǔ)

7、。1 材料與方法 1 ． 1 動物 S P F級 雄性 L e wi s 大 鼠 ( 4周 鼠齡 ， 1 2 0g 左右) 。由北京維通 利華實驗動物技術(shù)有限公司 提供 ( 北京 市實驗 動 物質(zhì) 量合 格證 ： 0 0 3 1 4 9 2 ) 。1 ． 2 主要試劑和藥 品a — ME M 培養(yǎng)基 ( G i b c o 公 司 ) ， D ME M— L G 培 養(yǎng) 基 ( Gi b e o公 司 ) ， P e r e o 1 1

8、 分 離 液( P h a r m a e i a 公司) ， 胎牛血清( 杭 州四季青生物工 程材 料有 限公 司 ) ， 青 、 鏈 霉 素 ( S ea 公 司) ， 胰 酶 ( A mr e s c o公 司 ) ，乙二 胺 四 乙 酸 ( E D T A， Gi b c o公 司 ) ， 茜 素 紅 ( S i g ma 公 司 ) ， 蘇 丹 Ⅳ醇 ( S i g ma公 司 ) ，D NA分 析試 劑盒 ( C o u l

9、 t e r 公 司 ) ， 倉 鼠抗 大 鼠一 c I ： h 。 一F I T C ( P h a r Mi n g e n公 司) ， 小 鼠抗大 鼠一 C D 4一 F I T C( C a l t a g e 公 司) ， 小 鼠抗大 鼠一 C D 9 0 一 F I T C ( C a l t a g e 公 司) ， 小鼠抗大鼠一 C D 3 4 一 P E ( S 眥 aC r O z 公司) 。收稿 日期： 2 0 0

10、 5 ． 0 4 ． 0 5修回 日期 ： 2 0 0 5 — 0 7 ． 1 4基金項 目： 福建省教育廳科研基金資助項 目( J B 0 4 2 1 1 )作者單位： 1 ． 福建省腫瘤醫(yī)院 麻醉科 ， 福州 3 5 0 0 1 42 ． 福建醫(yī)科大學(xué) 附屬第一 醫(yī)院 麻醉科 。 福 州 3 5 0 0 0 53 ． 福建省立醫(yī)院 心血管 研究所 心外科 。 福州 3 5 0 0 0 14 ． 福建醫(yī)科大學(xué) 附屬 口腔醫(yī)院種植 中心

11、， 福州 3 5 0 0 0 2作者簡介 ： 鄭輝哲 ( 1 9 7 1 ～) ， 男， 主治 醫(yī)師 。 醫(yī)學(xué)碩士 ．1 ． 3 原代大 鼠 MS C分離培 養(yǎng) 采用離心分離和 貼壁培養(yǎng)法nJ 。處死大 鼠， 無菌條 件下獲取雙側(cè) 股骨和脛骨。用 D ME M— L G培養(yǎng)液( 每 1 0mL含肝 素 5 0mg ) 沖 出骨 髓 ， 充 分 吹 打 混 勻 后 制 成 4×1 0m L -懸液。將細(xì)胞懸液緩慢地疊加到預(yù)先裝有

12、等量 P e r c o l 1 分 離 液 ( 1 ． 0 7 3g ／ L ) 的離 心 管上 層， 11 0 0r ／ mi n 離 心 3 0mi n ， 收取 位 于分 離介 質(zhì)之 間的單個 核 細(xì)胞。P B S洗滌兩 遍， 加 入 D ME M— L G全培 養(yǎng)液 ( 含 1 0 ％胎牛血 清， 1 0 0u ／ mL青霉 素， 1 0 0u ／ m L鏈 霉素 ) ， 以 1 ． 5×1 0c m的密 度 接種

13、于 培養(yǎng) 瓶 中，在 3 7℃、 體積分?jǐn)?shù)為 0 ． 0 5的飽和濕度 培養(yǎng)箱內(nèi)培 養(yǎng)， 2 4 和 7 2h 后各換 液一次， 去 除非 貼壁細(xì)胞。 以后每 3 ～4d 換液 1 次。細(xì)胞生長達(dá)到 8 0 ％～9 0 ％融合 時， 用 0 ． 0 5 ％胰 酶 +0 ． 0 2 ％ 乙二 胺 四 乙酸 ( E D T A ) 消化， 1 ： 3 傳代擴(kuò)增培養(yǎng)。1 ． 4 細(xì)胞表面標(biāo)記物檢測 0 ． 2 5 ％胰酶 + 0 ． 0 2

14、％E D T A消化收獲第 1 代和第 3 代 細(xì)胞， 與飽和濃度 的 抗 C I ： h 9 一 F I TC 、 C D 4 5 一 F I T C、 C D 3 4 一 P E、 C D 9 0 一 F I T C單克隆抗體及 其同型對照混勻， 室溫下閉光反應(yīng) 2 0mi n ， P B S洗 滌 細(xì) 胞 ， 行 流 式 細(xì) 胞 儀 檢 測 ， E X P O 3 2 ．V1 ． 2軟件分析。1 ． 5 促進(jìn) MS C向成骨和成脂

15、細(xì)胞分化 取第 6 代 細(xì)胞 ， 換為 含 1 0 ％胎牛血清 的 a — M E M 培養(yǎng)液， 每 6 -7d換液， 讓 細(xì)胞處于半饑餓狀態(tài)， 用倒置相差 顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化， 2 0d后分別行茜 素紅染 色 顯 示 是 否 鈣 鹽 沉 積 ， A KP染 色 顯 示 是 否 產(chǎn) 生 A K P和蘇丹 Ⅳ醇染色有否 出現(xiàn)脂肪 ； 用正常培養(yǎng)的 第 4 代細(xì)胞做對照。維普資訊 http://www.cqvip.com 口A 鈣化結(jié)節(jié)

16、； B 鈣化蛄[ 船． 見 自搿塊圉 3ME M 培 養(yǎng)彼 培養(yǎng) 1 5d的第 6 代 骨髓 1充質(zhì)干 細(xì) 胞( x2 0 0 )圖 4ME M 培養(yǎng) 掖培 養(yǎng) 1 5d的筇 6 代 骨 髓問克藤 干細(xì) 眥 ． A K P船 色陽 性 ( ×2 0 0 )A胞質(zhì)有脂墑沉著 ． B月w染I圖 5nME M 培 養(yǎng)漬 培 _ 蕎 的 第6 代 骨髓 刨充 質(zhì)干 細(xì)胞 ( x2 0 0 )24 細(xì) 胞增殖周期 ( 圈 6 )第5

17、代細(xì) 胞／ G ， 期細(xì) 胞 占 6 89 ％S 十 G 2 + M 期 為 3 11 ％二倍 體細(xì)胞 占總數(shù) 8 43 ％， 其 中 G 0 ／ G I 期細(xì) 胞 為 7 7 ． 4 ％． S 十G 2 + M 期 為 2 2 ． 6 ％異 倍體 封 Ⅱ 胞 占總 數(shù) 1 57 ％．其中 G o ／ G 1 期 細(xì)胞 為 2 3 ％， S + G 2 +M 期 為 7 7 ％，D NA 指 數(shù) ( D I )1 ． 7 7 7由 于骨

18、 髓的細(xì) 胞組成復(fù) 雜． 細(xì) 胞功能 各異． 萁中幅建 醫(yī)科 大 學(xué)學(xué) l 報 2 0 0 5年 l 0 月 第 3 9 卷第 4 期 囂％sPmLc ” 。T0”6 41 2 8 【 9 22 5 63 2 03 8 44 4851 2圈6 第5 代 目倚問 充質(zhì) J ． 細(xì) 胞 增殖周 期 曲線 MS C含量 很低 ， 約為骨 髓低密 度組分 中有核 細(xì)胞的 0 ． 0 0 1 ％～00 1 ％． 故分離高 純 度的 M S C是

19、原 代培 養(yǎng)關(guān)鍵 性技 術(shù)¨】 。筆者 采 用Pc 0 n 密度 梯度 分離 和 貼壁培養(yǎng)相 結(jié)合的方 法， 即利 用 P e r c Q t [ 將大 部分 造 血細(xì)胞 和單個核 細(xì)胞分 離， 經(jīng)過 體 外貼壁 培養(yǎng)換 液 擊除懸 浮生 長的 造血 干 細(xì)胞 ． 分離 獲得 MS C 的純 度達(dá)到 9 0 ％左右 ． 與 P i t t e n g e 等報道 相近 J 。間充 質(zhì)干細(xì)胞 沒有特 異性 表 面抗原 ， 但

20、研究發(fā) 現(xiàn)問充質(zhì) 干細(xì)胞有 如下特 點 ： 不表 達(dá) c、 C5 ， 而只表達(dá) C D 2 9C D 4 4 、 Cl 、 C D 9 0 等基質(zhì) 細(xì)胞 和問質(zhì) 細(xì)胞柏特異 ’ 睦表面標(biāo) 志抗原 】卒 研究選 擇 rC D 2 9 、C O 9 0 、 C D和 C D 4 5 進(jìn) 行檢 測。 結(jié)果 表明， 培 養(yǎng)的 細(xì)咆 c9 和 c D 9 0 陽性 ， C D和 c5 陰 住， 符合 MS C的特點 。同時表 明． 第 3 代 M

21、 S C的 CC D 的陽性率和 C DC D 4的陰性 率 比第 1 代高， 提 示 MS C的連綞培 養(yǎng)是其不 斷純化 的過程 由 于 可 充質(zhì)千 細(xì)胞 沒有 特異 性表 面抗體 ， 救 其鑒定仍 是一個 難躕 。目前． MS C 鑒定方 法都是 通過 在培養(yǎng)過 程 中出現(xiàn)分 化表型 ． 然后 逆推得 知是 否為MS C間充質(zhì) 干細(xì)胞 具有 多向分 化 潛能． 能分 化為成骨細(xì)胞 、 軟骨 細(xì)胞 及 脂腑 細(xì)胞J 。間充 質(zhì)干 細(xì)胞

22、還可能 具有可塑 性。 即 成體干 細(xì)胞 能產(chǎn) 生與它 存在部位組 織不 同的其他 組織類 型特 異 細(xì)胞， 有些 研究認(rèn)為 ， 問充 質(zhì)干細(xì)胞 能誘導(dǎo)分 化為心肌 細(xì)胞 、 神經(jīng)細(xì)胞等 1 。但是 ， 關(guān)于 成體 于 細(xì)胞 是否 縣有 可塑 性還存在很 大爭議 ， 有 一種 觀點 認(rèn)為 可塑性 是細(xì)胞 融合的喪象 J 。所 以， 筆者 選擇 在體 外促進(jìn) 所 培養(yǎng) 的細(xì) 咆向成骨 細(xì)胞和 成脂 細(xì)咆 分化 的方法 來逆推 。研究結(jié)