慢病毒過(guò)表達(dá)DMRT1基因在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化中的作用.pdf

1、第一部分、大鼠DMRT1基因慢病毒過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建
　　目的：探索構(gòu)建大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中DMRT1過(guò)表達(dá)慢病毒載體的技術(shù)方法。
　　方法：提取SD大鼠睪丸組織總RNA通過(guò)RT-PCR獲取cDNA文庫(kù)；據(jù)Genebank獲得大鼠DMRT1編碼區(qū)全長(zhǎng)序列，按照慢病毒載體酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)DMRT1上下游引物，通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）獲得DMRT1基因片段；與雙酶切線性化的慢病毒載體質(zhì)粒（Ubi-MCS-3FLAG-SV40-E

2、GFP）連接，完成過(guò)表達(dá)DMRT1的慢病毒載體質(zhì)粒的構(gòu)建；然后經(jīng)過(guò)氨芐青霉素抗性篩選、陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子PCR鑒定，進(jìn)行陽(yáng)性克隆測(cè)序鑒定。通過(guò)重組病毒質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝并獲取慢病毒液，采用定量PCR測(cè)定慢病毒滴度。
　　結(jié)果：PCR以及測(cè)序結(jié)果顯示成功構(gòu)建含有大鼠DMRT1基因的重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞可觀察到明顯的綠色熒光，經(jīng)Western blot檢測(cè)，F(xiàn)lag標(biāo)簽蛋白陽(yáng)性，說(shuō)明重組質(zhì)粒

3、轉(zhuǎn)染正常、重組質(zhì)粒熒光標(biāo)記基因GFP表達(dá)正常。包裝并檢測(cè)慢病毒濃縮滴度為2.0×108 TU/mL。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建DMRT1基因慢病毒過(guò)表達(dá)載體，獲得DMRT1基因過(guò)表達(dá)慢病毒，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供病毒支持。
　　第二部分、DMRT1基因過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染雄性大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞
　　目的：建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)DMRT1基因的SD雄性大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞群。
　　方法：通過(guò)全骨髓培養(yǎng)法得到SD雄性大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,

4、并使用成骨和成脂誘導(dǎo)方法對(duì)其進(jìn)行分化鑒定。將獲得的DMRT1基因過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染第三代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。使用Real-PCR和Western Blot技術(shù)檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中DMRT1 mRNA和蛋白水平的過(guò)表達(dá)情況。
　　結(jié)果：慢病毒有效感染SD雄性大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，可觀察到明顯的綠色熒光。與陰性病毒對(duì)照組和正常大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組相比，慢病毒過(guò)表達(dá)組在mRNA水平上表達(dá)明顯增高（P＜0.01），采用2-Δ

5、ΔCT法分析CT值，過(guò)表達(dá)慢病毒組的DMRT1基因的mRNA的相對(duì)表達(dá)量為正常rBMSCs組的512倍。過(guò)表達(dá)慢病毒組的DMRT1蛋白相對(duì)表達(dá)量為正常rBMSCs組的6倍。
　　結(jié)論：SD雄性大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中成功穩(wěn)定過(guò)表達(dá)DMRT1基因。為進(jìn)一步研究DMRT1基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的作用機(jī)制，對(duì)精子發(fā)生以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向雄性生殖細(xì)胞誘導(dǎo)分化具有重要意義。
　　第三部分、過(guò)表達(dá)DMRT1對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分

6、化作用
　　目的：探討轉(zhuǎn)錄因子DMRT1對(duì)雄性大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多能性因子以及減數(shù)分裂相關(guān)因子的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：將實(shí)驗(yàn)分為三組，第一組：只添加培養(yǎng)基的未處理組；第二組：在培養(yǎng)基內(nèi)添加RA全反式維甲酸進(jìn)行體外誘導(dǎo)的正常組；第三組：陰性對(duì)照病毒組，先用陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后在培養(yǎng)基內(nèi)添加RA全反式維甲酸進(jìn)行體外誘導(dǎo)；第四組：DMRT1過(guò)表達(dá)慢病毒組，先用慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后在培養(yǎng)基內(nèi)添加RA全反式維甲酸進(jìn)行體外誘導(dǎo)。

7、每組細(xì)胞分別誘導(dǎo)培養(yǎng)1d、7d、14d、21d，收集細(xì)胞。通過(guò)Real-PCR技術(shù)檢測(cè)內(nèi)源多潛能因子、減數(shù)分裂相關(guān)因子的表達(dá)情況，Western Blot技術(shù)用于檢測(cè)DMRT1過(guò)表達(dá)對(duì)STRA8蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：未處理組rBMSCs只表達(dá)內(nèi)參β-actin和低水平的DMRT1、OCT4基因，并不表達(dá)STRA8、SYCP3、DDX4、SOX2和NANOG基因。RA誘導(dǎo)過(guò)表達(dá)DMRT1的BMSCs第7天和第14天過(guò)表達(dá)慢病毒

8、組STRA8的mRNA相對(duì)表達(dá)量低于正常組和陰性對(duì)照組，第14天STRA8的蛋白相對(duì)表達(dá)量也低于正常組和陰性對(duì)照組。（P<0.05）。誘導(dǎo)第7天和第14天過(guò)表達(dá)組OCT4 mRNA表達(dá)量低于正常組和陰性對(duì)照組，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。三組細(xì)胞在誘導(dǎo)第21天均出現(xiàn)了DDX4 mRNA的表達(dá)，均未檢測(cè)出SYCP3、SOX2和NANOG基因的表達(dá)。
　　結(jié)論：在BMSCs中DMRT1具有抑制減數(shù)分裂相關(guān)因子STRA8的表達(dá)的功能，但是并未發(fā)現(xiàn)D