Pcp4基因在骨髓間充質(zhì)干細胞體外骨向分化過程中的表達.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細胞(bone malTOW mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潛能，在特定條件下可以向成骨細胞、成軟骨細胞、成脂細胞、成肌細胞等多種細胞分化，是組織工程研究中常用的種子細胞。迄今為止，觸發(fā)和控制BMSCs向成骨細胞方向分化的基因機制仍未明晾。本研究目的在于建立大鼠BMSCs的分離、純化、培養(yǎng)及體外骨向分化誘導體系，應用基因芯片技術(shù)篩選BMSCs向成骨細胞方向分化的差異表達基因，并采用實時

2、熒光定量PCR(real．time fluorescence quantitmive PCR，RQ-PCR)技術(shù)在細胞學水平上定量檢測篩選出的基因在BMSCs骨向分化過程中表達量的變化，分析其變化趨勢，為深入了解BMSCs骨向分化的分子調(diào)控機制和功能學研究奠定基礎。 本研究采用密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化BMSCs，進行原代培養(yǎng)，當貼壁細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底約80％時傳代，將第三代的BMSCs加入骨向誘導液行骨向誘導，通過觀察細

3、胞形態(tài)、描繪細胞生長曲線、計算細胞倍增時間、定量檢測堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原免疫組織化學染色、茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色等對未誘導和骨向誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞的生物學特性進行研究。在上述實驗的基礎上，在相同的培養(yǎng)條件下，取第三代的BMSCs行骨向誘導，骨向誘導后14天的細胞作為實驗組，未誘導的0天細胞作為對照組，提取0天和骨向誘導后14天的細胞的RNA，應用基因芯片技術(shù)篩選BMSCs向成骨細胞方向分化的差異表達基因。在相同條件下，同樣取第三代的BM

4、SCs，將行骨向誘導的BMSCs作為實驗組，未誘導的0天細胞作為對照組，分別提取0天和骨向誘導后4天、1周、2周和3周5個不同時相細胞的RNA，對細胞的總RNA質(zhì)量和RT-PCR．(reversetranscription polymerase chain reaction，RT-PCR)產(chǎn)物等進行質(zhì)控分析，采用實時熒光定量PCR技術(shù)對篩選出的差異表達基因在BMSCs骨向分化過程中的表達量變化進行連續(xù)性研究，分析其變化趨勢，并利用生物信

5、息學方法對其與成骨相關的功能進行初步探討。 研究結(jié)果顯示采用的密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法獲得了純度高的BMSCs，用含β-甘油磷酸鈉、地塞米松、左旋抗壞血酸和維生素D3的骨向誘導液對第三代的BMSCs進行誘導培養(yǎng)，成功誘導BMSCs骨向分化。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，誘導培養(yǎng)基和原代培養(yǎng)基對細胞生長的影響無明顯差異，原代培養(yǎng)基培養(yǎng)的BMSCs的倍增時間為30小時，骨向誘導后其倍增時間為40小時；BMSCs經(jīng)過骨向誘導后，形態(tài)學上表現(xiàn)出典型的成

6、骨細胞改變；加入誘導液培養(yǎng)的BMSCs堿性磷酸酶活性明顯增加，而未誘導細胞的堿性磷酸酶活性仍保持較低水平，無明顯變化；骨向誘導1周后，細胞I型膠原免疫化學染色呈陽性反應；BMSCs經(jīng)骨向誘導后2周可見明顯的礦化結(jié)節(jié)形成，茜素紅染色表現(xiàn)為細胞間片狀紅染的類圓形的致密不透光團塊。應用基因芯片技術(shù)成功篩選出BMSCs向成骨細胞方向分化的差異表達基因浦肯野細胞蛋白4(Purkinje cell protein 4，Pcp4)基因。實時熒光定量P

7、CR結(jié)果表明，在：BMSCs向成骨細胞分化過程的5個時段，Pcp4基因的表達量呈上升趨勢，其中Pcp4基因在第7天時的表達量比第0天的對照組升高了7倍，在第14天時的表達量比第0天的對照組升高了9倍，在第21天時的表達量比第0天的對照組升高了6倍，其表達量的峰值在第14天，與應用基因芯片技術(shù)的檢測結(jié)果完全符合，說明在BMSCs向成骨細胞分化的過程中，Pcp4為上調(diào)表達基因。通過結(jié)合生物信息學方法分析，我們作出了如下推測：礦化結(jié)節(jié)的形成是

8、成骨能力的可靠指標，Pcp4有調(diào)節(jié)Ca<'2+>結(jié)合動力學的能力，可能參與促進鈣鹽的沉積、形成礦化結(jié)節(jié)；在BMSCs骨向分化的過程中，蛋白激酶路徑的激活是BMPs活化信號的關鍵，而Pcp4與CaM依賴性蛋白激酶的激活有關，參與了PKA的調(diào)控，而且Pcp4有突觸傳遞功能，因此認為Pcp4可能與BMPs之間存在某種信號傳導關系。Pcp4基因與成骨有關的具體功能值得深入研究。 綜上所述，本研究采用密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離純化大鼠

9、BMSCs，獲得了高純度的BMSCs，采用骨向誘導液成功誘導BMSCs成骨定向分化。應用基因芯片技術(shù)首次成功篩選出BMSCs向成骨細胞方向分化的差異表達基因Pcp4基因。采用實時熒光定量。PCR技術(shù)，對應用基因芯片技術(shù)篩選出的BMSCs骨向分化過程中的差異表達基因Pcp4在不同時相的表達量進行連續(xù)性研究，結(jié)果表明在BMSCs向成骨細胞分化的5個時段，Pcp4基因的表達量呈上升趨勢，其表達量的峰值在第14天。表明Pcp4基因介導了BMSC