表達(dá)草酸分解基因的成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:原發(fā)性高草酸尿癥（Primary Hyperoxalurias，PHs）是由于肝臟特異性酶缺乏引起機(jī)體草酸代謝障礙，草酸在體內(nèi)大量生成，從而引起一系列臨床癥狀的先天性疾病。臨床上PHs患者通常表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)生腎結(jié)石、腎鈣質(zhì)沉著癥和腎衰竭。肝移植和肝腎聯(lián)合移植目前仍然是I型PHs的主要治療手段。但可供移植的肝來(lái)源少、移植手術(shù)難度大、手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)及術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率高一定程度上限制了手術(shù)的應(yīng)用。細(xì)胞移植對(duì)機(jī)體的影響相比器官移植要小得多。肝細(xì)胞

2、移植的發(fā)展有望在未來(lái)成為治療PHs的主要手段。由于人類成熟肝細(xì)胞很難在體外大量的增殖、生存期短且快速細(xì)胞表型去分化，因此獲得足夠數(shù)量可代謝草酸的肝細(xì)胞及可靠的肝細(xì)胞來(lái)源是首要問(wèn)題。產(chǎn)甲酸草酸桿菌（Oxalobacter fomigenes，Ox.F）是一類可分解草酸的微生物，其降解草酸的過(guò)程主要由FCoAT和OCoAD兩種關(guān)鍵酶參與，分別由frc和oxc基因編碼。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Human mesenchymal stem cell

3、s，hMSCs）具有向不同組織細(xì)胞分化的潛能，在體外經(jīng)特定條件下可向肝細(xì)胞分化。越來(lái)越多證據(jù)表明hMSCs有望替代肝細(xì)胞成為肝細(xì)胞移植的種子細(xì)胞。根據(jù)hMSCs的特點(diǎn)，本課題在前期實(shí)驗(yàn)中選用了hMSCs細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)的種子細(xì)胞，通過(guò)基因工程技術(shù)將從Ox.F中分離出來(lái)的草酸分解基因frc和oxc導(dǎo)入hMSCs并在細(xì)胞中成功表達(dá)，并在體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了轉(zhuǎn)染了目的基因的hMSCs（hMSCs-frc-oxc）具備有降解草酸的功能。本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步證實(shí)

4、hMSCs-frc-oxc可向肝細(xì)胞分化，分化為肝細(xì)胞后該細(xì)胞仍具備降解草酸的功能。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)染了Ox.F草酸分解基因frc和oxc的hMSCs（hMSCs-frc-oxc）并誘導(dǎo)其向肝細(xì)胞分化，并在分化成功后檢測(cè)分化為肝細(xì)胞后的細(xì)胞代謝草酸的能力。從而獲得大量可降解草酸的肝細(xì)胞，為肝細(xì)胞移植治療PHs尋找可靠的細(xì)胞來(lái)源。為hMSCs作為種子細(xì)胞治療PHs的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料和方法體外培養(yǎng)P4代

5、hMSCs-frc-oxc，通過(guò)含40ug/L肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）+10ug/L成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4（FGF-4）所組成的培養(yǎng)液誘導(dǎo)其向肝細(xì)胞分化。分化過(guò)程中通過(guò)觀察不同時(shí)間段細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。在分化第14天，第28天分別行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、Western blot技術(shù)和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)不同分化時(shí)間段細(xì)胞內(nèi)的肝細(xì)胞特異性標(biāo)記物(AFP、ALB、CK-18)以及草酸分解基因（frc和oxc）的表達(dá)情況。細(xì)胞成

6、功向肝細(xì)胞分化后，利用離子色譜儀檢測(cè)成功分化為肝細(xì)胞后的細(xì)胞培養(yǎng)液中草酸濃度從而判斷細(xì)胞的草酸降解功能。前期實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染了空病毒載體的hMSCs（hMSCs-vector）以及人成熟肝細(xì)胞L-02分別作為陰性對(duì)照組及陽(yáng)性對(duì)照組。
　　結(jié)果：hMSCs-frc-oxc可在體外成功培養(yǎng)。經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)逐漸變短，似多角形。RT-PCR可檢測(cè)經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的hMSCs-frc-oxc可成功表達(dá)肝臟特異性標(biāo)志物（ALB、AFP和CK-18

7、）和草酸分解基因（frc和oxc）。未經(jīng)誘導(dǎo)的hMSCs-frc-oxc和hMSCs-vector未能表達(dá)肝臟特異性標(biāo)志物。hMSCs-vector（無(wú)論誘導(dǎo)與否）未能表達(dá)草酸分解基因frc和oxc。Western blot技術(shù)檢測(cè)hMSCs-frc-oxc在誘導(dǎo)第14、28d細(xì)胞中AFP、CK-18較未誘導(dǎo)組表達(dá)明顯增加（P<0.05），并可成功表達(dá)草酸分解基因產(chǎn)物（融合蛋白 myc-FCoAT和flag-OCoAD）。免疫熒光細(xì)胞化

8、學(xué)檢測(cè)誘導(dǎo)28d后hMSCs-frc-oxc可成功表達(dá)ALB，未經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)則呈陰性。離子色譜儀結(jié)果顯示成功肝細(xì)胞分化后的hMSCs-frc-oxc仍具有草酸降解功能，其草酸降解能力與未經(jīng)誘導(dǎo)的hMSCs-frc-ocx相似。而作為對(duì)照組的hMSCs-vector和正常人成熟肝細(xì)胞L-02細(xì)胞組則幾乎無(wú)草酸降解功能。
　　結(jié)論：hMSCs-frc-oxc體外經(jīng)過(guò)一定條件下可成功向肝細(xì)胞分化，表達(dá)肝臟特異性的標(biāo)記物及具有部分肝細(xì)胞