人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞.pdf

1、目的：探討體外誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells，hBMSCs)定向誘導(dǎo)分化為心肌樣細(xì)胞的實驗條件。 方法：取成人棄骨骨髓，通過全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)hBMSCs。在傳至第三代時，篩選具有心肌特異性分化潛能的c-kit<'+>的hBMSCs細(xì)胞克隆，用含20％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)克隆培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70％融合時，分別用10μtmol/

2、15-氮胞苷(5-azacytidine crystalline，5-aza)，100mg/l參麥注射液，10μmol/15-氮胞苷和100mg/l參麥注射液3組誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)hBMSCs。24小時后，更換為含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在誘導(dǎo)3周后，通過顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測心肌特異性標(biāo)記抗原Desmin和肌鈣蛋白T的表達(dá)；用RT-PCR方法檢測心肌特異基因心房利尿肽(atrial natriure

3、tic peptide，ANP)和腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)表達(dá)。 結(jié)果：骨髓中含有多種hBMSCs細(xì)胞克隆，其中成纖維細(xì)胞樣克隆表達(dá)c-kit<'+>。分別用3組誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)c-kit<'+>細(xì)胞15天后，部分細(xì)胞胞體明顯增粗，可見有些細(xì)胞間有融合樣現(xiàn)象發(fā)生。誘導(dǎo)3周后，3組都有類似肌管樣細(xì)胞出現(xiàn)，細(xì)胞短粗，呈不規(guī)則的圓柱形，有分支，互相連成網(wǎng)。蘇木精-伊紅(hematoxylin-eo

4、sin HE)染色后，3組細(xì)胞都排列規(guī)則，類似于心肌細(xì)胞的形態(tài)，可見部分細(xì)胞有排列規(guī)則的橫紋樣結(jié)構(gòu)。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示誘導(dǎo)3周后的hBMSCs，Desmin陽性細(xì)胞數(shù)目分別是：5-aza組(65.3±4.7％)，參麥注射液組(62.3±3.9％)，5-aza和參麥注射液組(68.5±2.1％)，3組Desmin陽性細(xì)胞表達(dá)率無顯著差異：cTnT陽性細(xì)胞數(shù)目分別是：5-aza組(62.2±4.1％)，參麥注射液組(63.8±3.4％)，5-

5、aza和參麥注射液組(66.0±6.2％)，3組Desmin陽性細(xì)胞表達(dá)率無顯著差異。陰性對照組和未分化的hBMSCs均無Desmin和cTnT的表達(dá)。RT-PCR顯示3種不同的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)hBMSCs3周后都有ANP，BNP的表達(dá)，未分化的hBMSCs無ANP，BNP的表達(dá)。 結(jié)論：5-aza和中藥可以誘導(dǎo)c-kit<'+>的hBMSCs細(xì)胞克隆分化為心肌樣細(xì)胞。體外誘導(dǎo)成的心肌樣細(xì)胞表現(xiàn)為未成熟心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能特征。證明骨