依達(dá)拉奉體外定向誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞.pdf

1、目的:制備人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymalstem cells，hUMSCs)，檢測其表面標(biāo)志物，研究在不同濃度下依達(dá)拉奉(Edaravone)定向誘導(dǎo)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的可行性及適宜條件，探討作用機(jī)制，為進(jìn)一步在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面廣泛應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步體內(nèi)相關(guān)實驗研究提供實驗依據(jù)。
　　方法:在無菌條件下選取足月健康新生兒臍帶10cm，置于H-DMEM

2、/F12培養(yǎng)基中，放置于4℃溫箱內(nèi)保存，移送至細(xì)胞培養(yǎng)室，用D-Hank's將標(biāo)本中的積血完全沖洗干凈，剔除臍動脈和臍靜脈，將臍帶間質(zhì)組織按照1mm3的大小分割成組織塊，用0.2％膠原酶Ⅱ消化，放入含有20％胎牛血清(FBS)、2ng/ml表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、25 mM左旋谷氨酰胺(L-Glu)、100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下動態(tài)觀察其形態(tài)學(xué)特征變化及增殖情況。當(dāng)有約9

3、0％左右的細(xì)胞貼壁生長時，加入胰酶消化細(xì)胞、制成細(xì)胞懸液，并傳代。
　　采用流式細(xì)胞術(shù)檢測消化細(xì)胞的細(xì)胞表型，包括CD105、CD90、CD73、CD19、CD34、CD45、CD11b以及組織相容性抗原HLA-DR(MHC-Ⅱ)，用抗鼠IgG1-PE和IgG1-FITC作為同型對照。
　　P1代細(xì)胞是指原代hUMSCs按1∶1傳代后得到的細(xì)胞。在倒置顯微鏡下動態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，當(dāng)約90％左右的細(xì)胞貼壁生長時即可進(jìn)行傳代

4、，傳代分瓶的比例一般為1∶2，繪制細(xì)胞生長曲線。取正常傳代至P4代的hUMSCs，當(dāng)大約有90％左右的細(xì)胞貼壁生長時，通過離心法制成細(xì)胞懸液，分別置入六孔板及25 cm2塑料培養(yǎng)瓶中，共分為A、B、C、D四組，前三組作為實驗組，最后1組為對照組。A、B、C組分別加入含有依達(dá)拉奉(Edaravone)濃度依次為50mg/L、100mg/L、300mg/L的誘導(dǎo)液，每孔含誘導(dǎo)液3ml，每瓶含誘導(dǎo)液5ml，誘導(dǎo)液均用L-DMEM培養(yǎng)基配制，D

5、組只加L-DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)，倒置相差顯微鏡動態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。分別于誘導(dǎo)的第1、2、4、6、12、18、24小時統(tǒng)計各組細(xì)胞變化率，繼續(xù)培養(yǎng)共24小時，采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測各標(biāo)志物陽性率，各組各時點細(xì)胞陽性率，結(jié)果以(x)±s表示，最后選取較適合的誘導(dǎo)濃度。使用Western blot及RT-PCR的方法檢測較合適濃度誘導(dǎo)組細(xì)胞神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、巢蛋白(Nestin)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFA

6、P)、微管相關(guān)蛋白2(MAP-2)蛋白及mRNA水平的情況。
　　結(jié)果:原代細(xì)胞通過離心法傳代培養(yǎng)12h后，大約有60％的細(xì)胞逐漸貼壁，細(xì)胞形態(tài)為菱形、圓點形或者長梭形;隨著培養(yǎng)時間延長，貼壁的細(xì)胞數(shù)量慢慢增加，大部分細(xì)胞形態(tài)變?yōu)殚L梭形;約90％左右的細(xì)胞貼壁生長時，倒置顯微鏡鏡下觀察到細(xì)胞呈放射螺旋狀生長。當(dāng)細(xì)胞融合完全時，按1∶2比例繼續(xù)傳代培養(yǎng)，hUCMSCs的增殖能力極其旺盛，傳代至P15代細(xì)胞均可迅速生長繁殖。
　

7、　通過流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)分別檢測P3、P5和P10代hUCMSCs，表面分子標(biāo)志物結(jié)果顯示各代均表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志CD73、CD90和CD105，而不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD11b、CD19、CD34、CD45和組織相容抗原HLA-DR。
　　加入不同濃度Edaravone后，A組細(xì)胞1h后可見零星細(xì)胞胞體收縮，折光性增強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)殚L橢圓形或圓形，伸出一條或多條細(xì)長的突起，可視為神經(jīng)樣細(xì)胞;4h后神經(jīng)樣細(xì)胞約有20％，細(xì)胞伸出的突

8、起數(shù)量變多，突起的長度及分叉的數(shù)量都有所增加，6h后神經(jīng)樣細(xì)胞約占總細(xì)胞的40％，12h后有約50％的細(xì)胞發(fā)生以上改變，相鄰細(xì)胞伸出的突起會逐漸相互交纏連接成網(wǎng)狀，24h時神經(jīng)樣細(xì)胞所占比例達(dá)到頂峰，只有少數(shù)細(xì)胞沒有變?yōu)樯窠?jīng)樣細(xì)胞，但可見少量細(xì)胞脫落;B組在加入Edaravone1h后即可看到明顯變化，大量細(xì)胞胞體收縮，胞體兩側(cè)會伸出細(xì)長的突起，神經(jīng)樣細(xì)胞約占40％，4h時可見約70％的細(xì)胞發(fā)生這樣的變化，12h時神經(jīng)樣細(xì)胞所占比例達(dá)到

9、頂峰，并逐漸有少量細(xì)胞開始脫落;C組細(xì)胞1h時即可見大量細(xì)胞變?yōu)樯窠?jīng)樣細(xì)胞，4h時變化的細(xì)胞達(dá)到頂峰，直至24h均保持高變化率，脫落的細(xì)胞不多。D組為對照組，連續(xù)觀察24h與添加誘導(dǎo)液前無明顯改變。于誘導(dǎo)分化12h時，通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測各組細(xì)胞的神經(jīng)標(biāo)志物。A、B、C三組NSE陽性率依次為54.03±1.76％、80.87±2.03％、90.97±4.06％; Nestin的陽性率為59.64±2.38％、81.70±3.08％、

10、92.98±3.04％;、GFAP的陽性率為53.53±2.93％、78.26±4.17％、88.27±2.36％; MAP-2為陰性，C組細(xì)胞(誘導(dǎo)液濃度為300mg/L)表達(dá)各神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物陽性率最高且穩(wěn)定。通過RT-PCR技術(shù)檢測C組細(xì)胞0h、2h、4h、6h、12h、24h(以空白組為0h)的各神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物及內(nèi)參GAPDG的表達(dá)量，計算相對表達(dá)量。GFAP的mRNA相對表達(dá)量依次為0、0、0.238±0.014、0.298±0

11、.010、0.504±0.696、0.597±0.054;NSE的mRNA相對表達(dá)量依次為0、0.275±0.020、0.499±0.021、0.877±0.022、0.859±0.018、0.438±0.016;空白組即可微量表達(dá)Nestin，mRNA的相對表達(dá)量隨時間的延長依次為0.244±0.009、0.654±0.025、0.794±0.041、0.915±0.049、0.898±0.044、0.408±0.012;誘導(dǎo)前后始終

12、未見表達(dá)MAP-2，各組各時間點均可高表達(dá)GAPDH。繼續(xù)通過Westren blot技術(shù)檢測C組細(xì)胞各時間點均神經(jīng)標(biāo)志物的表達(dá)量，GFAP的蛋白相對表達(dá)量依次為0、0、0.203±0.021、0.221±0.023、0.353±0.022、0.746±0.037;NSE的蛋白相對表達(dá)量依次0、0.323±0.038、0.403±0.026、0.557±0.021、0.553±0.025、0.214±0.030;Nestin的蛋白相對表

13、達(dá)量隨時間的延長依次0.385±0.014、0.507±0.017、0.842±0.008、0.861±0.007、0.886±0.018、0.466±0.010;未見表達(dá)MAP-2，各組各時間點均可高表達(dá)GAPDH。
　　結(jié)論: hUMSCs作為一種能夠在體外穩(wěn)定培養(yǎng)、傳代的干細(xì)胞，P15代以內(nèi)均可迅速生長繁殖，通過流式細(xì)胞技術(shù)檢分別檢測P3、P5和P10代hUCMSCs，表面分子標(biāo)志物結(jié)果顯示各代均表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志CD73