終絲誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞.pdf

1、背景和目的：干細(xì)胞(stemcell)研究是20世紀(jì)與21世紀(jì)之交生命科學(xué)中的強(qiáng)大潮流，其基礎(chǔ)研究及開發(fā)應(yīng)用將打開對(duì)疾病治療的突破口，成為21世紀(jì)生物產(chǎn)業(yè)的核心內(nèi)容之一。神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)是干細(xì)胞的一種，Reynolds等于1992年首先從成年小鼠腦紋狀體分離出能在體外不斷分裂增殖、具有多種分化潛能的細(xì)胞群，并正式提出了神經(jīng)干細(xì)胞的概念。NSCs不僅可以作為研究神經(jīng)發(fā)育的模型，并且可作為潛在的移植細(xì)胞

2、的來源，為臨床治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了一個(gè)新的有效治療途徑。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)積累了治療多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動(dòng)物模型，并為治療神經(jīng)系統(tǒng)各種先天性、退行性疾病及后天性損傷疾病提供了大量的理論依據(jù)。然而如何獲得足夠數(shù)量的可移植細(xì)胞且避免倫理道德及臨床方面的爭(zhēng)議成為目前NSCs替代治療的一大障礙。近年來，國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者證明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemesenchymalstemcells，BMSCs)在體內(nèi)外適宜條件下可以轉(zhuǎn)化成神經(jīng)樣細(xì)胞，并且能促進(jìn)

3、神經(jīng)功能的恢復(fù)，這為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了一個(gè)新的手段。終絲是脊髓圓錐末端聯(lián)系尾骨的連接物，它曾被簡(jiǎn)單地認(rèn)為是血管附著物，但后來組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在終絲內(nèi)存在著神經(jīng)組織。國(guó)外曾對(duì)成人終絲進(jìn)行了免疫過氧化酶染色，也得出終絲中含有大量膠質(zhì)細(xì)胞、分散的神經(jīng)元細(xì)胞及其他組織。近來，國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明神經(jīng)組織液在體外合適條件下可以誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但多為損傷或正常腦或脊髓組織，用終絲進(jìn)行誘導(dǎo)還未見報(bào)道。那么能否用終絲勻漿液來誘導(dǎo)BMSCs

4、分化為神經(jīng)樣細(xì)胞呢?本實(shí)驗(yàn)就這一目的探討人終絲勻漿上清液體外誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的可行性，為將來進(jìn)一步探討研究終絲及BMSCs的生物學(xué)特性或獲取治療用種子細(xì)胞提供論理依據(jù)。 材料與方法：由一名7歲骨髓相正常的TCS患兒術(shù)前自愿捐獻(xiàn)骨髓。將骨髓標(biāo)本緩慢疊加到淋巴細(xì)胞分離液上進(jìn)行離心，取中間白色云霧狀細(xì)胞層(含有BMSCs)。將分離得到的BMSCs在DMEM/F12培養(yǎng)基+10％胎牛血清中進(jìn)行無(wú)分化培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞接近融合時(shí)進(jìn)

5、行傳代。術(shù)中留取該患兒之終絲稱濕重后進(jìn)行勻漿，離心后取上清，纖維素濾膜過濾除菌，所得液體-20℃冰箱中保存。將第四代細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的培養(yǎng)皿中進(jìn)行爬片，各組均加入含有bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)10ng/ml的培養(yǎng)液，促進(jìn)細(xì)胞分裂。24h后撤去bFGF，實(shí)驗(yàn)組加入無(wú)血清培養(yǎng)基及勻漿上清液誘導(dǎo)，對(duì)照組只加培養(yǎng)基，72小時(shí)后免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。統(tǒng)計(jì)分析神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物NF(神經(jīng)微絲蛋白)、NSE(神經(jīng)元特異性烯醇化酶)、GFA

6、P(神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，得出結(jié)論。 結(jié)果：誘導(dǎo)2h后觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)已經(jīng)開始發(fā)生變化：BMSCs胞體向胞核收縮且變得致密及有折光性，漸漸變?yōu)轭愃棋F形、多角形及類圓形，從胞體開始伸出突起，突起延長(zhǎng)成細(xì)絲狀，到第2d時(shí)相鄰細(xì)胞的突起已經(jīng)相互交織成網(wǎng)狀，表現(xiàn)為大小不一、形狀不同但有自細(xì)胞發(fā)出突起的典型神經(jīng)樣細(xì)胞。大約有17％的細(xì)胞發(fā)生上述形態(tài)學(xué)變化。染色后每個(gè)指標(biāo)隨機(jī)選擇10個(gè)視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，算出平均值。NF陽(yáng)性率為15.