MicroRNA-128調(diào)控大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞.pdf

1、背景與目的：
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrow mesenchymal stemcells，BMSC）是干細(xì)胞家族的重要成員，是一種被認(rèn)為具有多種分化潛能的細(xì)胞，特定的誘導(dǎo)條件下BMSC在體內(nèi)或體外，可分化為骨、軟骨、脂肪、韌帶、肌腱、肌肉、肝、心肌、內(nèi)皮、甚至神經(jīng)等多種組織細(xì)胞。近年來(lái)，人們對(duì)BMSC在細(xì)胞治療和基因治療中的作用進(jìn)行了大量的研究，日益受到人們的關(guān)注。
　　miRNA(microRNA)是由約22個(gè)

2、核苷酸組成的單鏈小RNA，并在真核生物細(xì)胞中廣泛存在。近些年來(lái)的各項(xiàng)研究表明miRNA一個(gè)非常龐大的家族，存在于是在植物、線蟲、果蠅、小鼠、大鼠和人等多個(gè)物種中。miRNA對(duì)各種進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控是通過在轉(zhuǎn)錄后水平與其靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致mRNA的翻譯、翻譯抑制以及降解。一個(gè)異常復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)由miRNA與靶mRNA分子組成，參與包括細(xì)胞繁殖與凋亡，細(xì)胞分化與發(fā)育，以及逆境應(yīng)答等多種生物學(xué)過程。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)可具有多向

3、分化潛能，能分化成多種類型的結(jié)締組織，如骨組織、軟骨組織，也可分化成神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)易于在體外擴(kuò)增，來(lái)源又比較廣泛，是目前組織工程中一種重要的種子細(xì)胞。各種生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、組織分化以及疾病發(fā)生等miRNA均參與調(diào)控，其同時(shí)它眾多生物體發(fā)育和行為等的變化miRNA同樣起著決定作用。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA分子在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平參與控制骨髓基質(zhì)干細(xì)胞多種基因的時(shí)空表達(dá)差異，

4、并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高水平表達(dá)。而Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑參與激活骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的定向分化。我們利用生物信息學(xué)軟件分析，推測(cè)Wnt3a是microRNA-128的靶基因，microRNA-128可能通過調(diào)控Wnt3a影響骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的定向分化。因此，本實(shí)驗(yàn)通過探討過表達(dá)microRNA-128對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的影響及對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的機(jī)制。
　　整個(gè)研究分為兩部分:

5、　　第一部分:大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)和miR-128過表達(dá)對(duì)神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的影響
　　方法:
　　1.取4周齡150g左右的SD大鼠收集骨髓分離培養(yǎng)，收集第3代細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志CD29，CD34、CD44、CD45、CD105。
　　2.BMSC細(xì)胞達(dá)到90％匯合時(shí)，將細(xì)胞消化使用BTX2001電轉(zhuǎn)。類似物組:轉(zhuǎn)染miR-128mimics，加入bFGF和EGF誘導(dǎo);抑制劑組:轉(zhuǎn)染miR-1

6、28inhibitor，加入bFGF和EGF誘導(dǎo);誘導(dǎo)組:不轉(zhuǎn)染，但加入bFGF和EGF誘導(dǎo);空白組:不轉(zhuǎn)染不誘導(dǎo)。
　　3.RT-PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞miR-128表達(dá)水平。
　　4.TaqMan探針熒光定量RT-PCR檢測(cè)法，分別檢測(cè)β3-tubulin，MAP-2，NF-M，NSE，GFAP，Nestin，Vimentin，Wnt3amRNA表達(dá)水平。
　　5.Western-blot分別檢測(cè)β3-tubuli

7、n，MAP-2，NF-M，NSE，GFAP，Nestin，Vimentin，Wnt3a蛋白表達(dá)水平。
　　6.免疫熒光方法分別檢測(cè)GFAP，Nestin蛋白表達(dá)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　7.細(xì)胞免疫化學(xué)方法檢測(cè)Nestin蛋白表達(dá)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　8.采用SPSSV17.0軟件，數(shù)據(jù)以mean±SD表示，兩組間使用t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析，以α＜0.05為差異顯著。
　　結(jié)果:
　　1.第3代細(xì)

8、胞已表達(dá)BMSCs細(xì)胞表型陽(yáng)性特征，其CD29、CD44、CD105，陽(yáng)性率分別為99.26％，99.14％，98.45％;CD34、CD45呈陰性，陽(yáng)性率分別為1.58％，1.82％。
　　2.空白組細(xì)胞miR-128的表達(dá)水平與誘導(dǎo)對(duì)照組差異無(wú)顯著性(P＞0.05);而抑制劑組細(xì)胞miR-128的表達(dá)水平顯著低于2個(gè)對(duì)照組（空白組，誘導(dǎo)對(duì)照組）(P＜0.01);類似物組細(xì)胞miR-128的表達(dá)水平顯著高于2個(gè)對(duì)照組(P＜0.0

9、1)。
　　3.神經(jīng)元樣細(xì)胞標(biāo)志(β3-tubulin，MAP-2，NF-M，NSE，GFAP,Nestin，Vimentin)和Wnt3amRNA的表達(dá)量，在有bFGF和EGF誘導(dǎo)的誘導(dǎo)組、類似物組和抑制劑組均高于空白對(duì)照組細(xì)胞，差異有顯著性(P＜0.05);其中抑制劑組細(xì)胞的表達(dá)量高于誘導(dǎo)組細(xì)胞，差異有顯著性(P＜0.05)，類似物組細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量低于誘導(dǎo)組細(xì)胞，差異有顯著性(P＜0.05)。
　　4.7種神經(jīng)元樣細(xì)胞

10、標(biāo)志蛋白β3-tubulin，MAP-2，NF-M，NSE，GFAP,Nestin，Vimentin在四組細(xì)胞中均未見免疫印跡出現(xiàn)。在加人bFGF和EGF誘導(dǎo)的3組，其中類似物組細(xì)胞的蛋白印跡均顯著弱于誘導(dǎo)組細(xì)胞，同時(shí)抑制劑組細(xì)胞的印跡均顯著強(qiáng)于誘導(dǎo)組細(xì)胞。說明轉(zhuǎn)染miR-128Inhibitor下調(diào)miR-128可促進(jìn)bFGF和EGF誘導(dǎo)神經(jīng)元樣細(xì)胞標(biāo)志的高水平表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miR-128mimic上調(diào)miR-128可抑制bFGF和EG

11、F誘導(dǎo)神經(jīng)元樣細(xì)胞標(biāo)志的表達(dá)。
　　5.神經(jīng)元樣細(xì)胞標(biāo)志蛋白GFAP和Nestin免疫熒光強(qiáng)度依次為，抑制劑組＞誘導(dǎo)組＞類似物組;具有的神經(jīng)元細(xì)胞學(xué)特征抑制劑組＞誘導(dǎo)組＞類似物組;空白組無(wú)熒光顯現(xiàn)。
　　6.Nestin免疫化學(xué)染色強(qiáng)度和具有的神經(jīng)元細(xì)胞學(xué)特征依次為，抑制劑組＞誘導(dǎo)組＞類似物組＞空白組;抑制劑組細(xì)胞形態(tài)上非常接近神經(jīng)元細(xì)胞。
　　第二部分MicroRNA-128調(diào)控大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化

12、機(jī)制的影響
　　方法:
　　1.使用網(wǎng)上在線分析軟件miRanda，miRDB，RNA22，TargetScan和miRWalk分析預(yù)測(cè)miRNA-128與Wnt3a基因結(jié)合調(diào)控區(qū)(seedregion)。
　　2.采用overlapPCR方法，以大鼠基因組DNA為模本擴(kuò)增出野生型/突變型Wnt3a基因3'UTR區(qū)，構(gòu)建野生型/突變型報(bào)告基因載體。分別與miR-128/Scramble共轉(zhuǎn)染BMSC，測(cè)定熒光素酶活性。

13、
　　3.構(gòu)建缺3'UTR的Wnt3a真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Wnt3a，進(jìn)行rescue實(shí)驗(yàn)。
　　4.合成Wnt3asiRNA，與miR-128共轉(zhuǎn)染BMSC進(jìn)行進(jìn)行rescue實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果:
　　1.Target預(yù)測(cè)顯示W(wǎng)nt3a基因3'UTR區(qū)存在與miRNA-128結(jié)合的8merseedregion。
　　2.測(cè)序分析證實(shí)構(gòu)建出Wnt3a基因3'UTR區(qū)野生型/突變型報(bào)告基因載體;野生型

14、報(bào)告基因載體與miR-128細(xì)胞Luc熒光素酶活性顯著減低，(P＜0.05)。
　　3.缺3'UTR的Wnt3a表達(dá)載體/miR-128共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，呈現(xiàn)出miR-128負(fù)調(diào)控Wnt3a表達(dá)失效。
　　4.Wnt3asiRNA沉默細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化效應(yīng)，與轉(zhuǎn)染miR-128Mimic完全一致，
　　結(jié)論:
　　1.下調(diào)BMSC中miR-128水平可促進(jìn)bFGF和EGF誘導(dǎo)向神經(jīng)元樣分化，而上調(diào)則對(duì)其有抑制作用。<