大鼠視網(wǎng)膜勻漿上清液體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：隨著眼科臨床和基礎(chǔ)研究的進(jìn)步，白內(nèi)障、角膜病等可得到有效控制和治療，但一些致盲性視網(wǎng)膜疾患如視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關(guān)性黃斑變性、青光眼視神經(jīng)視網(wǎng)膜病變等采用目前的方法無法逆轉(zhuǎn)。目前青光眼視神經(jīng)保護(hù)的策略是在有效降低眼壓的基礎(chǔ)上，針對(duì)視神經(jīng)損害的不同環(huán)節(jié)，利用不同的藥物，保護(hù)患者視功能。通過移植細(xì)胞使視網(wǎng)膜細(xì)胞更新是治療神經(jīng)變性疾病的另一種方法，逐漸受到關(guān)注。本研究旨在探討體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的可能性和條件，為青光眼

2、視神經(jīng)視網(wǎng)膜損害及其它視網(wǎng)膜退行性疾病的治療提供種子細(xì)胞奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：本課題選用大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，根據(jù)其取材方便，便于體外擴(kuò)增，可自身取材，來源豐富，免疫源性低等特性，對(duì)BMSCs進(jìn)行體外誘導(dǎo)為神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行研究。本研究包括2部分：1.大鼠BMSCs的培養(yǎng)和鑒定采用貼壁篩選法獲得BMSCs，體外增殖純化，獲得純化干細(xì)胞。流式細(xì)胞儀細(xì)胞鑒定。2.BMSCs經(jīng)bFGF預(yù)誘導(dǎo)后，以β-巰基乙醇(β-BM)和視網(wǎng)膜勻漿上清液

3、為誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)。用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞免疫組織化學(xué)法檢測(cè)誘導(dǎo)后各組細(xì)胞巢蛋白(Nestin)，神經(jīng)絲蛋白(NF)，神經(jīng)元特異烯醇化酶(NSE)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)等特異性標(biāo)志物的表達(dá)。 結(jié)果：1.大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定：(1)細(xì)胞分離培養(yǎng)通過貼壁法能獲得純度較高的BMSCs，原代培養(yǎng)3天后細(xì)胞呈紡錘形。7天后細(xì)胞呈團(tuán)簇、集落狀生長。細(xì)胞傳代后，24h細(xì)胞大部分貼壁，傳代后細(xì)胞增殖旺盛，仍呈梭形。

4、傳代過多細(xì)胞增殖減慢，可見到一些扁平，寬大的細(xì)胞。(2)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)CD90、CD29、CD44，不表達(dá)CD34、CD45、CD31。(3)多向分化潛能在含有誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基中，BMSCs可在體外分化成為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞。(4)10％血清濃度為BMSCs生長最佳濃度。(5)不同傳代細(xì)胞增殖能力不同，P1和P3代細(xì)胞強(qiáng)于P8代細(xì)胞。2.體外神經(jīng)分化：(1)β-BM體外誘導(dǎo)BMSCs分化加入5mmol/lβ-BM1h左右開

5、始細(xì)胞質(zhì)向核收縮，胞體變小，變圓，透亮，并出現(xiàn)細(xì)胞突起，隨時(shí)間延長部分細(xì)胞胞體收縮，細(xì)胞突起變細(xì)、變長，呈雙極及多極，但數(shù)量不多。5h后更多細(xì)胞出現(xiàn)類神經(jīng)細(xì)胞改變，細(xì)胞突起相互交織。少數(shù)細(xì)胞懸浮。誘導(dǎo)1h后Nestin陽性率高于NSE和NF，差異有顯著性(P<0.01)；誘導(dǎo)5h后Nestin陽性率低于NSE和NF，差異有顯著性(P<0.01)。NSE陽性率1h和5h，差異無顯著性(P>0.05)。Nestin：1h高于5h，差異有顯著

6、性(P<0.01)。NF：1h低于5h，差異有顯著性(P<0.01)加入10mmol/Lβ-BM誘導(dǎo)30min左右細(xì)胞開始出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞樣形態(tài)，但較多細(xì)胞懸浮。誘導(dǎo)1h后陽性率NSE>NF>Nestin，差異有顯著性(P<0.001)，誘導(dǎo)5h后Nestin陽性率低于NSE和NF，差異有顯著性(P<0.01)。NSE和NF：陽性率1h低于5h(P<0.01)，Nestin則相反。各組GFAP和對(duì)照組抗體染色陽性率在任何時(shí)間較其它抗體明顯

7、低，差異有顯著性(P<0.01)。(2)視網(wǎng)膜勻漿上清液誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)元細(xì)胞分化兩組不同濃度視網(wǎng)膜勻漿上清液均能誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化，與β-BM相比作用比較緩和，3天為分化高峰。誘導(dǎo)細(xì)胞存活時(shí)間1周以上。大鼠視網(wǎng)膜勻漿上清液誘導(dǎo)24h后，不同濃度組Nestin陽性率均明顯高于NSE和NF，差異有顯著性(P<0.01)。誘導(dǎo)3d后Nestin抗體染色陽性細(xì)胞數(shù)量減少，大部分神經(jīng)元樣細(xì)胞NSE和NF染色陽性，差異有顯著性(P<

8、0.01)。誘導(dǎo)7d后，Nestin抗體染色陽性細(xì)胞明顯減少，大部分神經(jīng)元樣細(xì)胞NSE和NF染色陽性，差異有顯著性(P<0.01)。NSE與NF：誘導(dǎo)24h比3d和7d陽性細(xì)胞率低，差異有顯著性(P<0.01)。3d和7d差異無顯著性(P>0.05)。高濃度組陽性細(xì)胞率高，差異有顯著性(P<0.01)。Nestin：隨誘導(dǎo)時(shí)間延長陽性率逐漸降低，各組差異均有顯著性(P<0.01)。高濃度組陽性細(xì)胞率高，差異有顯著性(P<0.01)。各組

9、GFAP和對(duì)照組抗體染色陽性率在任何時(shí)間較其它抗體明顯低，差異有顯著性(P<0.01)。 結(jié)論：1.β-BM在體外可誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，5mmol/L濃度為最佳濃度。誘導(dǎo)細(xì)胞早期表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin，以后表達(dá)成熟神經(jīng)元標(biāo)志物NF，NSE，不表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP。誘導(dǎo)細(xì)胞存活時(shí)間短。2.視網(wǎng)膜勻漿上清液可在體外誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞；誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物與β-BM誘導(dǎo)細(xì)胞相似。勻漿液作用緩和