甲鈷胺體外誘導大鼠骨髓間充質干細胞向神經元樣細胞分化的初步研究.pdf

1、目的：通過體外培養(yǎng)骨髓間充質干細胞（BMSCs），初步探討不同劑量的甲鈷胺體外定向誘導BMSCs向神經元樣細胞分化的可行性，以及觀察分化后的細胞的生長和增殖情況，尋求一種較合理的甲鈷胺誘導濃度，為臨床上利用甲鈷胺誘導后的BMSCs進行細胞移植更好更有效的治療脊髓損傷提供前期研究依據(jù)。
　　方法：1、采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)和純化大鼠骨髓間充質干細胞，倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細胞生長情況、生物活性及形態(tài)學變化，免疫熒光細胞

2、化學檢測 BMSCs相對特異性表面標志物 CD44，證實實驗所需的細胞為BMSCs。
　　2、取生長狀態(tài)良好的第4-5代BMSCs，制成單細胞懸液，調整細胞濃度，實驗分為對照組（control組）和實驗組（分25ug/ml、50ug/ml和100ug/ml三個濃度組），實驗組分別加入不同濃度甲鈷胺的10％FBS L-DMEM培養(yǎng)基，對照組加入10%FBS L-DMEM，不加任何誘導劑，各組以24h、48h、72h為觀察記錄的時間坐

3、標軸，在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細胞形態(tài)學變化和生長狀態(tài)，MTT法檢測誘導后細胞的生長和增殖情況，RT-PCR和western blotting方法鑒定分化的神經前體細胞的特異性標志物神經巢蛋白（neuroepithelial stem cell protein，Nestin）和神經細胞的特異性標志物神經元特異性烯醇化酶（neon-specific enolase，NSE）的表達。
　　結果：1、原代細胞接種24-48小時后可見貼壁細

4、胞，貼壁細胞單個散在分布，多數(shù)細胞呈小圓形或橢圓形。72小時后可見散在的梭形細胞，一周左右細胞形成集落，細胞呈梭形、三角形或星形。原代培養(yǎng)約兩周，細胞增殖明顯加快，集落中的細胞增殖成“漩渦狀”，具有典型的成纖維細胞樣形態(tài)，免疫熒光細胞化學鑒定顯示BMSCs細胞表面標志物CD44表達陽性，造血干細胞表面抗原CD34表達陰性。
　　2、BMSCs經25ug/ml、50ug/ml和100ug/ml誘導24h、48h和72h后，各實驗組細

5、胞折光性增強，部分細胞呈現(xiàn)神經元樣變化，具有神經元樣形態(tài)：細胞向周圍長出較長的突起，有立體感，折光性增強，倒置顯微鏡下觀察以100ug/ml組細胞折光性及突觸延長最為明顯，并且相鄰細胞間的突觸出現(xiàn)連接，而對照組細胞形態(tài)無明顯變化，仍然呈長梭形。MTT結果顯示24h、48h和72h各實驗組與對照組無顯著性差異（P＞0.05），RT-PCR與western blotting結果顯示不同劑量甲鈷胺誘導48h后，Nestin和NSE在mRNA和

6、蛋白水平表達均上調，其中100ug/ml組表達上調最明顯，與control組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；同樣，100ug/ml甲鈷胺誘導24h、48h和72h后，Nestin和NSE在mRNA和蛋白水平表達均上調，其中72h表達上調最明顯，與control組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論：1、甲鈷胺可定向誘導BMSCs向神經元樣細胞分化，分化后的細胞具有一定的增殖能力；甲鈷胺對分化后的細胞生長增