補(bǔ)陽(yáng)還五湯誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞分化.pdf

1、目的 探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯在MSCs向神經(jīng)細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化過(guò)程中的作用，為MSCs在神經(jīng)內(nèi)科學(xué)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法 取成年健康SD大鼠股骨和脛骨骨髓，密度梯度離心法分離獲取骨髓單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells，MNCs)。多次洗滌后，將細(xì)胞沉淀接種于含10％胎牛血清(FBS)的低糖DMEM(L-DMEM)培養(yǎng)液中，置于37℃、5％CO<,2>、飽和濕度的CO<,2>培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融

2、合后用0.25％胰酶消化傳代。培養(yǎng)3～6代的細(xì)胞接種于塑料培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)80％培養(yǎng)皿時(shí)，采用堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)培養(yǎng)24 h，以促進(jìn)細(xì)胞的增殖。然后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞應(yīng)用補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)大鼠MSCs(rMSCs)進(jìn)行體外定向誘導(dǎo)分化；對(duì)照組細(xì)胞不加任何誘導(dǎo)劑。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)誘導(dǎo)1h、3h后神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物一巢蛋白(nestin)的表達(dá)，以及誘導(dǎo)5 h后神經(jīng)元標(biāo)記

3、物一神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)和星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物-膠質(zhì)細(xì)胞纖維酸性蛋白(glail fibrillary acidic protein，GFAP)的表達(dá)，分別計(jì)數(shù)各種分化細(xì)胞的陽(yáng)性率。 結(jié)果 1. 分離后的大鼠骨髓MSCs(rMSCs)在體外培養(yǎng)條件下，呈增殖性生長(zhǎng)。傳代后的rMSCs約3天左右可擴(kuò)增一倍。 2.MSCs經(jīng)誘導(dǎo)1 h后，即有部分細(xì)胞呈現(xiàn)神經(jīng)元樣

4、形態(tài)，誘導(dǎo)5 h結(jié)束時(shí)，大部分細(xì)胞具有典型神經(jīng)元樣形態(tài)：較多的神經(jīng)元樣細(xì)胞聚集在一起，相鄰細(xì)胞間的軸突聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀。 3. 對(duì)照組MSCs僅表達(dá)少量nestin和NSE，陽(yáng)性率分別為1.6％±0.8％和5.8％±2.6％。實(shí)驗(yàn)組MSCs誘導(dǎo)1h、3h后nestin陽(yáng)性率分別為40.5％±2.3％和29.0％±3.4％，nestin的表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組誘導(dǎo)5h后NSE的陽(yáng)性率為86.8％±2.7％，與