兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：神經(jīng)細(xì)胞屬終末分化細(xì)胞，神經(jīng)系統(tǒng)受損傷后無(wú)法通過(guò)神經(jīng)細(xì)胞的再生而得以恢復(fù)。近幾年來(lái)，通過(guò)移植神經(jīng)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病，已取得了一定的成果。但成人的神經(jīng)干細(xì)胞不易獲得，胚胎干細(xì)胞來(lái)源有限，且異體移植也容易產(chǎn)生排斥反應(yīng)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是存在于成年骨髓中的一種干細(xì)胞，具有多向分化潛能，在不同的誘導(dǎo)條件下能分化成中胚層來(lái)源的間質(zhì)細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、

2、肌腱細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。近年的研究顯示，MSC的終末分化有可能跨越胚層界限，而向?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，如分化為心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。MSC易于獲得，擴(kuò)增迅速，移植無(wú)免疫排斥反應(yīng)，可通過(guò)血腦屏障，提示MSC有望作為一種理想的種子細(xì)胞，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中發(fā)揮重要的作用。 應(yīng)用MSC進(jìn)行細(xì)胞治療的關(guān)鍵因素，首先是要獲得較高純度的MSC進(jìn)行體外擴(kuò)增，其次是在體外定向誘導(dǎo)分化有較高的轉(zhuǎn)化率，這樣才能滿(mǎn)足細(xì)胞治療時(shí)所需的細(xì)胞數(shù)量。本

3、研究旨在探索一種分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并誘導(dǎo)其向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的有效方法，為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。 方法： 1 MSC的分離培養(yǎng)無(wú)菌條件下抽取6月齡雄性新西蘭白兔雙側(cè)髂骨骨髓，Perc01分離液(相對(duì)密度1.073)密度梯度離心，獲取骨髓單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)反復(fù)換液，傳代培養(yǎng)，得到相對(duì)純化的MSC。每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化。繪制原代、2、5、8代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。HE染色觀察細(xì)胞

4、形態(tài)。 2 體外誘導(dǎo)MSC分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞取體外培養(yǎng)擴(kuò)增的3～6代MSC以1×10<'5>/ml的濃度接種于6孔培養(yǎng)板，采用含有1mmol/L β-巰基乙醇、10％胎牛血清的DMEMM培養(yǎng)液預(yù)誘導(dǎo)24h，再用含6mmol/L β-巰基乙醇的無(wú)血清培養(yǎng)液誘導(dǎo)6h，倒置顯微鏡下密切觀察誘導(dǎo)前后細(xì)胞的形態(tài)改變，免疫組化測(cè)定誘導(dǎo)前后神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)情況，定量分析。 結(jié)果：

5、 1 細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及形態(tài)變化PerC01分離液分離后所獲細(xì)胞主要為圓形單個(gè)核細(xì)胞，其中混有少量的紅細(xì)胞，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定，活細(xì)胞的比例達(dá)95％以上。 原代細(xì)胞接種后見(jiàn)大量圓形細(xì)胞懸浮存在，輪廓清晰，24h后即有少量細(xì)胞貼壁，24h～48h貼壁細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞呈現(xiàn)類(lèi)圓形或不規(guī)則形態(tài)，胞核質(zhì)分界清晰，折光性強(qiáng)。接種后3d～4d貼壁細(xì)胞明顯增多，8d～10d細(xì)胞呈集落生長(zhǎng)，部分細(xì)胞開(kāi)始拉長(zhǎng)，伸出偽足變成短梭形或星形，向

6、周?chē)瘦椛錉钆帕?，?xì)胞核較大，胞漿中顆粒較多，呈圓形或橢圓形。12d后貼壁細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形外觀，部分區(qū)域融合成片。13d～14d細(xì)胞融合成單層，呈典型細(xì)長(zhǎng)梭形外觀。但繼續(xù)培養(yǎng)后細(xì)胞可呈多層生長(zhǎng)，無(wú)明顯接觸抑制現(xiàn)象。傳代細(xì)胞于傳代接種后12h貼壁，迅速生長(zhǎng)，6d～8d爬滿(mǎn)瓶底。各代細(xì)胞形態(tài)基本一致，均為長(zhǎng)梭形。 2 培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)測(cè)定從原代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)上看出，原代培養(yǎng)時(shí)間潛伏期較長(zhǎng)，一般為4d～5d，8d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞增殖明顯加

7、快，14d左右進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞增殖速度趨于平緩。從2、5、8代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)上看出，傳代細(xì)胞生長(zhǎng)潛伏期則只有1d～2d，3d～4d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，持續(xù)4d～5d，7d～8d進(jìn)入平臺(tái)期。而且隨傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞的增殖能力有所下降。 3 HE染色光鏡觀察MSC呈長(zhǎng)梭形，多角形等，胞漿粉紅色，呈細(xì)網(wǎng)狀，細(xì)胞核深藍(lán)色，位于中央，可見(jiàn)分裂相。 4 體外誘導(dǎo)及免疫組化分析MSC經(jīng)預(yù)誘導(dǎo)液(含1mmol/L β-巰基乙醇、10％胎

8、牛血清的DMEM培養(yǎng)液)預(yù)誘導(dǎo)24h后，倒置顯微鏡下觀察到長(zhǎng)梭形細(xì)胞胞質(zhì)向胞核收縮，變?yōu)椴灰?guī)則形和圓形，少量細(xì)胞脫落死亡。加入誘導(dǎo)液(含6mmol/L β-巰基乙醇的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液)誘導(dǎo)后，細(xì)胞逐漸長(zhǎng)出較長(zhǎng)的突起，突起繼續(xù)延長(zhǎng)出現(xiàn)一級(jí)分支和二級(jí)分支，而且折光性增強(qiáng)，呈現(xiàn)神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)。免疫組化分析誘導(dǎo)2h、6h后的神經(jīng)元樣細(xì)胞，NSE染色陽(yáng)性，GFAP染色陰性，誘導(dǎo)6h后NSE染色陽(yáng)性率為72.6±11.3％。誘導(dǎo)分化前的MSC