成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：體外分離、培養(yǎng)成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hBMSCs)，研究hBMSCs生物學(xué)特性。觀察依達(dá)拉奉聯(lián)合堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bpFGF)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)誘導(dǎo)hBMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的作用，鑒定神經(jīng)元樣細(xì)胞功能，為臨床進(jìn)行神經(jīng)元樣細(xì)胞移植治療脊髓損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.抽取健康成人骨髓，密度梯度離心和貼壁法分離和純化hBMSCs，原代培養(yǎng)2周后傳代，觀察細(xì)胞形態(tài)特征

2、，繪制生長(zhǎng)曲線，流式細(xì)胞儀鑒定其表面抗原，測(cè)定克隆形成率，觀察成骨、成脂誘導(dǎo)。
　　 2.用依達(dá)拉奉、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和β-巰基乙醇誘導(dǎo)hBMSCs，觀察誘導(dǎo)分化后細(xì)胞形態(tài)變化，免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞NSE、GFAP、MAP2和Nestin表達(dá)，western blot檢測(cè)細(xì)胞膜離子通道蛋白Nav1.6、Kv1.2、Kv1.3、Cav1.2的表達(dá)，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)行細(xì)胞電生理功能檢測(cè)。
　　 結(jié)

3、果：
　　 1.密度梯度離心和貼壁法分離、純化培養(yǎng)的hBMSCs呈梭狀，具有均質(zhì)性好，細(xì)胞增值活力強(qiáng)、傳代生長(zhǎng)快的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的hBMSCs生長(zhǎng)曲線呈S形；流式細(xì)胞儀檢測(cè)hBMSCs表面抗原，結(jié)果顯示CD29、CD44、CD105陽(yáng)性，CD34、CD45陰性；8天和15天的克隆形成率分別為54％、93％；成脂誘導(dǎo)21天，油紅O染色呈橘紅色，成骨誘導(dǎo)28天，茜素紅染色呈深紅色。
　　 2.誘導(dǎo)后大部分細(xì)胞表現(xiàn)為富有突起

4、的錐狀細(xì)胞，突起延伸交織成網(wǎng)，依達(dá)拉奉+EGF+bFGF組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，優(yōu)于β-巰基乙醇組、依達(dá)拉奉組和EGF+bFGF組，呈現(xiàn)典型神經(jīng)元樣細(xì)胞。
　　 3.空白組NSE、GFAP、Nestin和MAP2表達(dá)均為陰性，依達(dá)拉奉+EGF+bFGF組NSE陽(yáng)性細(xì)胞率高于其他三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，P<0.05；GFAP在實(shí)驗(yàn)組中弱表達(dá)，Nestin、MAP2在實(shí)驗(yàn)組組中表達(dá)陰性。
　　 4.實(shí)驗(yàn)組和空白組均表達(dá)膜離子通道蛋白Nav1

5、.6、Kv1.2、Kv1.3、Cav1.2。實(shí)驗(yàn)組Nav1.6、Kv1.2、Kv1.3表達(dá)上調(diào)，Cav1.2表達(dá)基本不變。Kv1.2、Kv1.3表達(dá)與空白組比較，P<0.05。
　　 5.分化后的神經(jīng)元樣細(xì)胞靜息膜電位值增大，與空白對(duì)照有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；空白組和實(shí)驗(yàn)組中至少存在三種以上外向鉀電流，包括四乙銨(TEA)敏感的延遲整流鉀電流(IKDR)、克霉唑(clotrimazole)敏感鈣激活鉀電流(IKCa)和瞬間外向鉀電流(It

6、o)。分化后的神經(jīng)元樣細(xì)胞電流強(qiáng)度幅值顯著性增高。本實(shí)驗(yàn)尚未發(fā)現(xiàn)硝苯地平(nifedipine)敏感型的L-鈣電流(ICaL)和TTX敏感型的鈉電流(INa)。
　　 結(jié)論：
　　 1.用密度梯度法和貼壁法分離培養(yǎng)的hBMSCs具有自我更新、快速形成克隆能力和多向分化潛能。
　　 2.依達(dá)拉奉可以誘導(dǎo)hBMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，依達(dá)拉奉+EGF+bFGF誘導(dǎo)hBMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化作用高于其他組。