骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的誘導(dǎo)與帕金森病細(xì)胞模型的建立.pdf

1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的誘導(dǎo)與帕金森病細(xì)胞模型的建立DirectlyInductionofBoneMesenchymalStemCellstoNeuron—likeCellsandPreparationofthecellmodelsofParkinson’SDisease本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172284)江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目資助研究生：李

2、麗華導(dǎo)師：邢華副教授揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院二零一四年六月?lián)P州大學(xué)碩士學(xué)位論文法純化BMSCs；BMSCs傳代消化，繪制細(xì)胞的生長曲線：流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面特異因子；誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)，對BMSCs進(jìn)行向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的誘導(dǎo)，通過顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，并以免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測被誘導(dǎo)細(xì)胞神經(jīng)元特異性標(biāo)志nestin、NSE和GFAP的表達(dá)，驗(yàn)證BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的潛能。以全骨髓貼壁法純化培養(yǎng)的BMSCs，貼壁生長良好，傳代后，BMS

3、Cs生長曲線為S形；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面特異因子陽性表達(dá)率很高，符合BMSCs表面抗原的特征；細(xì)胞免疫化學(xué)染色顯示誘導(dǎo)后細(xì)胞的nestin和NSE陽性，GFAP陰性，說明體外誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元特異性烯醇化酶和神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，不表達(dá)膠質(zhì)纖維酸性蛋白，提示在體外被誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元樣細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。體外分離純化的BMSCs，細(xì)胞表面標(biāo)志符合BMSCs特征，提示貼壁培養(yǎng)法可以獲得高純度的BMSCs。在一定的條件下，BMSC

4、s在體外可以被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，說明BMSCs具有向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化的潛能，提示BMSCs有替代神經(jīng)細(xì)胞移植治療帕金森病的可能。實(shí)驗(yàn)二：帕金森病細(xì)胞模型的建立以PCI2細(xì)胞為對象，經(jīng)適當(dāng)處理，建立可用作帕金森病相關(guān)研究的PD細(xì)胞模型。建立PCI2細(xì)胞穩(wěn)定的培養(yǎng)體系，繪制細(xì)胞生長曲線；不同濃度的MPP處理PCI2細(xì)胞，比較不同濃度的MPP對PCI2細(xì)胞活力的影響，選擇最適宜的MPP濃度；以細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡和特異性蛋白asynucl

5、ein為指標(biāo)，檢測PD細(xì)胞模型的構(gòu)建情況。以MTT法檢測細(xì)胞活力，以Hoechst33342熒光染色觀察細(xì)胞凋亡，通過AO和EB染色法檢測細(xì)胞凋亡率，免疫熒光染色法檢測特異性蛋白(Itsynuclein的存在。培養(yǎng)體系穩(wěn)定、操作簡單，細(xì)胞貼壁迅速，活力較高，細(xì)胞生長曲線呈S形。不同濃度的MPP對PCI2細(xì)胞的影響不同，隨著MPP濃度的增加，PCI2細(xì)胞活力降低，當(dāng)MPP濃度高于5009M時(shí)，PCI2細(xì)胞活力不再顯著降低。Hoechst3