MicroRNA層面重塑骨髓間充質(zhì)干細胞提高其定向神經(jīng)元分化的研究.pdf

1、前言
　　脊髓損傷（spinalcordinjury,SCI）在臨床上越來越多見，是截癱的主要原因之一，給社會和家庭帶來沉重負擔(dān)。如何解決脊髓損傷后重新恢復(fù)原來的功能，成為現(xiàn)在神經(jīng)病學(xué)工作者研究的焦點和難題。脊髓損傷治療方法很多但是效果卻不佳。近期國內(nèi)外學(xué)者對神經(jīng)干細胞治療脊髓損傷進行了研究，但由于神經(jīng)干細胞(neuralstemcells，NSC)的來源主要是胚胎，受到倫理學(xué)和法律的制約，限制了其發(fā)展。由于骨髓間充質(zhì)干細胞(Bo

2、nemarrow-derivedmesenchymalstemcells，BMSCs)具有來源豐富、取材簡單、培養(yǎng)擴增容易、可以自體移植及沒有倫理爭議等優(yōu)勢，所以仍是未來的研究熱點。
　　BMSCs移植治療SCI有待解決的問題:(1)移植細胞的數(shù)量有限。(2)免疫排斥，炎癥反應(yīng)及局部缺血缺氧微環(huán)境不利于細胞生長。(3)膠質(zhì)瘢痕的形成阻礙細胞的遷移和分布。(4)移植的BMSCs定向神經(jīng)元分化率不高。本課題就是圍繞BMSCs定向神經(jīng)元

3、分化展開的。干細胞治療脊髓損傷是一個涉及多個方面的復(fù)雜問題。干細胞定向分化為神經(jīng)元的調(diào)控機制是關(guān)鍵問題之一。研究人員試圖通過增強或減弱某些基因和蛋白表達的方法，增加干細胞分化為神經(jīng)元的比例，但效果不是很理想。近來的研究表明，microRNA在干細胞自我更新及其分化中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。我們認為microRNA可能參與了干細胞定向分化為神經(jīng)元的過程，可能是定向誘導(dǎo)分化的重要靶點。
　　為了提高骨髓間充質(zhì)干細胞定向神經(jīng)元的分化率，通過

4、基因芯片技術(shù)比較體外培養(yǎng)的SD大鼠的BMSCs、神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元的microRNA表型，找出差異最明顯的microRNA，我們發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元相比，骨髓間充質(zhì)干細胞mir-124下調(diào)最為明顯，mir-199a-3p上調(diào)較為明顯，為了在BMSCs過表達mir-124，我們構(gòu)建了慢病毒載體pLVX-EN-rno-mir124，感染BMSCs后，獲得了mir-124的過表達。對于轉(zhuǎn)染后的BMSCs，我們通過免疫熒光，WesternB

5、lot，RT-PCR等方法進一證實了神經(jīng)元細胞早期標(biāo)志物，β-Ⅲ微管蛋白，MAP-2的表達率在mir-124過表達組都顯著升高，而在對照組沒有明顯變化。由此我們可以得出結(jié)論:mir-124和mir-199a-3p在骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化方面有重要的調(diào)節(jié)作用。
　　實驗方法
　　大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元的培養(yǎng)和鑒定，通過基因芯片技術(shù)對三種細胞進行全譜microRNA微點陣分析，比較骨髓間充質(zhì)干細胞與神經(jīng)干

6、細胞和神經(jīng)元之間的microRNA表達差異，挑選1～2條差異最明顯的（包含增高和減弱）microRNA進行后續(xù)研究，并用RealTimeRT-PCR及Westernblot法驗證這些microRNA的表達。
　　實驗一:設(shè)計rno-mir-124序列，并交由南京金斯瑞公司合成rno-mir-124序列，構(gòu)建到pUC57-simple載體上，用XhoⅠ、BamHⅠ將pUC57-Simple-rno-mir124及目的載體pLVX-E

7、GFP-IRES-neo雙酶切，然后進行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中。重組質(zhì)粒的純化和提取使用大量質(zhì)粒提取試劑盒。重組質(zhì)粒通過限制性酶切消化法，瓊脂糖凝膠電泳和核苷酸序列分析技術(shù)鑒定。通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒DNA瞬時轉(zhuǎn)染至293FT細胞中，通過逐級稀釋法測定滴度，然后感染骨髓間充質(zhì)干細胞，通過RT-PCR的方法驗證轉(zhuǎn)染后mir-124在骨髓間充質(zhì)干細胞中的表達。應(yīng)用免疫熒光，WesternBlot等方法進一步證實神經(jīng)元細胞

8、早期標(biāo)志物，β-Ⅲ微管蛋白，MAP-2的表達率在mir-124過表達組中的表達。
　　實驗二:設(shè)計下調(diào)rno-mir199a-3p的序列rno-mir199a-3p-sponge，并交由南京金斯瑞公司合成該片段，用XhoⅠ、BamHⅠ將rno-mir199a-3p-sponge片段及目的載體pLVX-EGFP-IRES-neo雙酶切，然后進行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中。待轉(zhuǎn)化步驟中得到的抗性（請根據(jù)載體抗性選擇）培養(yǎng)基上長出

9、菌落，選取幾個較大的周圍沒有雜菌的白色菌落用牙簽分別挑取，接種至5ml完全培養(yǎng)液內(nèi)，Amp+在培養(yǎng)液中的終濃度為100μg/ml，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。重組質(zhì)粒通過限制性酶切消化法，瓊脂糖凝膠電泳和核苷酸序列分析技術(shù)鑒定。通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒DNA瞬時轉(zhuǎn)染至293FT細胞中，通過逐級稀釋法測定滴度，然后感染骨髓間充質(zhì)干細胞，通過Western-Blot的方法驗證轉(zhuǎn)染后mir-199a-3p在骨髓間充質(zhì)干細胞中的表達。應(yīng)用免疫熒

10、光等方法進一步證實神經(jīng)元細胞早期標(biāo)志物，β-Ⅲ微管蛋白，MAP-2的表達率在mir-199a-3p下調(diào)組中的表達。
　　實驗結(jié)果
　　一、大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元的microRNA的表達。
　　基因芯片技術(shù)及RT-PCR技術(shù)證實與神經(jīng)干細胞、神經(jīng)元相比，mir-124的表達在骨髓間充質(zhì)干細胞中下調(diào)最為明顯;mir-199a-3p的表達在骨髓間充質(zhì)干細胞中，升高較為明顯。
　　二、成功構(gòu)建及檢測過表

11、達及抑制表達慢病毒載體
　　1、pLVX-EN-rno-mir-124的構(gòu)建:pUC57-rno-mir124經(jīng)BglⅡ和SalⅠ酶切將得到2.7Kb的載體帶和600bp左右的rno-mir-124條帶，測序結(jié)果顯示構(gòu)建序列與目的序列完全一致，構(gòu)建正確。用XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，預(yù)期切出約600bp左右的rno-mir-124片段帶和約8.9kb左右的載體帶。將陽性克隆送到長沙贏潤生物技術(shù)有限公司測序。將測序所得的序列

12、和rno-mir-124基因片段序列進行比對，顯示構(gòu)建序列與預(yù)期序列完成一致，pLVX-EN-rno-mir-124構(gòu)建成功。
　　2、pLVX-199a-3p-sponge的構(gòu)建:用EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切重組質(zhì)粒，預(yù)期切出約1kb左右的片段帶（EGFP+rno-mir199a-3P的總大小）和約8.0kb左右的載體帶。將陽性克隆送到長沙贏潤生物技術(shù)有限公司測序。將測序所得的序列和rno-mir199a-3p-sponge片

13、段序列進行比對，顯示構(gòu)建序列與預(yù)期序列完成一致，pLVX-199a-3p-sponge構(gòu)建成功。
　　三、轉(zhuǎn)染后的骨髓間充質(zhì)干細胞，mir-124表達上調(diào)，mir-199a-3p表達下調(diào)。
　　1、mir-124表達上調(diào)
　　感染293FT細胞4天后，通過計數(shù)綠色熒光蛋白的表達來評價病毒滴度。結(jié)果顯示根據(jù)熒光圖片中GFP表達情況，在加入1E-6稀釋度病毒液的整個孔中觀察到3個帶熒光的細胞，說明該孔中至少有3個病毒顆粒感

14、染了細胞，則該病毒的滴度等于帶有熒光的細胞數(shù)除以病毒原液量，本研究中就是3/2*（1E-6）=1.5E+6，所以滴度為1.5E+9TU/ml，排除操作誤差因素，我們可取滴度為5E+8用于實驗。pLVX-EN-rno-mir124慢病毒感染rBMSCs細胞，RT-PCR結(jié)果提示感染后的BMSCs細胞，mir-124的表達明顯升高。
　　2.mir-199a-3p表達下調(diào)
　　感染293FT細胞4天后，通過計數(shù)綠色熒光蛋白的表達

15、來評價病毒滴度。結(jié)果顯示根據(jù)熒光圖片中GFP表達情況，在加入1E-6稀釋度病毒液的整個孔中觀察到2個帶熒光的細胞，說明該孔中至少有2個病毒顆粒感染了細胞，則該病毒的滴度等于帶有熒光的細胞數(shù)除以病毒原液量，本研究中就是2/2*（1E-6）=1E+6，所以滴度為1E+9TU/ml，排除操作誤差，我們可取滴度為5E+8用于實驗。Western-Blot結(jié)果提示mir-199a-3p-sponge慢病毒感染BMSCs細胞后，mir-199a-3

16、p的靶點mTOR的表達明顯增強，間接證明mir-199a-3p下調(diào)。
　　四、過表達mir-124及抑制mir-199a-3p表達，使β-Ⅲ微管蛋白，MAP-2及突觸囊泡蛋白的表達明顯提高。
　　1、過表達mir-124的BMSCs
　　β-Ⅲ微管蛋白，MAP-2作為神經(jīng)元早期的標(biāo)志物，免疫熒光染色顯示與對照組及mir-124-比較，mir-124+組在體外培養(yǎng)的第六天顯著提高了β-Ⅲ微管蛋白的表達水平。同樣過表達mi

17、r-124，使MAP-2的表達水平顯著提高。Western-Blot檢測得到了相同的結(jié)論。突觸囊泡蛋白（Synaptophysin）是位于突觸囊泡上的膜蛋白，在由Ca2+信號介導(dǎo)的突觸囊泡轉(zhuǎn)運和泡吐過程起著重要的作用，作為突觸特異性標(biāo)志物，Synaptotagmins在科研中被廣泛使用。我們的研究證實突觸囊泡蛋白的表達水平，在mir-124+組也是明顯增強的。
　　2、抑制mir-199a-3p的BMSCs
　　免疫熒光染色

18、顯示與對照組及空白載體組比較，anti-mir-199a-3p組在體外培養(yǎng)的第六天顯著提高了β-Ⅲ微管蛋白的表達水平。同樣抑制mir-199a-3p，使MAP-2的表達水平顯著提高。
　　結(jié)論
　　1、載體pLVX-EN-rno-mir-124及pLVX-199a-3p-sponge的成功構(gòu)建。
　　2、慢病毒pLVX-EN-rno-mir-124感染BMSCs細胞，顯著提高了mir-124的表達。
　　3、慢病