骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導分化為肺泡上皮細胞的實驗研究.pdf

1、第一章、小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）的體外分離擴增及鑒定 目的：探討小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）體外進行分離、純化及鑒定的方法。 方法：采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁細胞分離法培養(yǎng)小鼠MSCs，觀察不同代細胞的形態(tài)及生長情況，流式細胞術(shù)檢測小鼠MSCs表面抗原CD34、CD45、CD105和CD106等的表達情況，并對小鼠MSCs進行純度測定。 結(jié)果：小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）原代培養(yǎng)接種24小時后可見

2、圓形細胞貼壁，72小時后貼壁細胞數(shù)量明顯增多，此時貼壁的細胞形態(tài)比較均一，為長梭形。在細胞培養(yǎng)的2～5天細胞增殖較慢，6～10天細胞快速增殖，呈“旋渦樣”排列。培養(yǎng)至11～13天，細胞接近80～90%融合，細胞形態(tài)均一。傳代后的小鼠MSCs呈梭形的成纖維細胞樣形態(tài)，傳代培養(yǎng)后的細胞不再以集落方式生長，而呈均勻性分布生長。分離純化后所得細胞活力為93.2±1.8%。流式細胞儀結(jié)果顯示第2代小鼠MSCs細胞均一性較好，在95%以上；CD34

3、、CD45表達陰性，CD105、CD106表達陽性。 結(jié)論：采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁細胞分離法體外分離和擴增小鼠MSCs，所得小鼠MSCs活力及純度均較高，可以作為小鼠MSCs的原代培養(yǎng)的常規(guī)方法；流式細胞技術(shù)可以鑒定體外分離培養(yǎng)的小鼠MSCs。 第二章、骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導分化的非接觸共培養(yǎng)模型 目的：建立體外非接觸共培養(yǎng)誘導小鼠MSCs向肺泡上皮細胞分化的實驗模型。 方法：采用密度梯度離心法結(jié)合

4、貼壁細胞分離法，體外分離培養(yǎng)小鼠MSCs，選取第3代小鼠MSCs。無菌條件下制備肺組織單細胞懸液。將小鼠肺細胞懸液接種于0.4um孔徑（Millpore）大小的膜上（懸掛式體外共培養(yǎng)小室），并放入24孔板中，在24孔板的底部接種小鼠MSCs。共設(shè)計三組：對照組：小鼠MSCs單獨靜置培養(yǎng)組；實驗組A：正常肺組織單細胞懸液+MSCs：實驗組B：損傷組肺組織單細胞懸液+MSCs。共同培養(yǎng)8天，每日倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及生長情況，透射電

5、鏡觀察MSCs的細胞超微結(jié)構(gòu)，激光共聚焦顯微鏡和熒光顯微鏡觀察共培養(yǎng)體系下室MSCs、SP-C和AQP5免疫熒光表達，RT-PCR檢測共培養(yǎng)體系下室中SP-C和AQP5 mRNA表達情況。 結(jié)果：小鼠MSCs的細胞生長情況：對照組：細胞增殖良好，形態(tài)不變，為長梭形，見個別寬大、扁平的細胞。實驗組A：共同培養(yǎng)的前4天，細胞形態(tài)基本為長梭形，第5天開始見少量細胞變?yōu)榱⒎叫?，并進而轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切危餐囵B(yǎng)8天，可見約30～40%的細胞轉(zhuǎn)

6、變?yōu)槎嘟切渭毎?。實驗組B：第2天開始，即可見部分細胞由長梭形逐漸變?yōu)榱⒎叫?，并進而轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切?，體積增大，隨著培養(yǎng)時間的延長，這種多角形細胞逐漸增多。培養(yǎng)8天時，大約60～70%的細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切渭毎?。不同處理組小鼠MSCs的增值情況比較顯示：實驗組B與對照組和實驗組A比較，共培養(yǎng)體系的下室中的細胞數(shù)目明顯增多（P<0.05）；但實驗組A與對照組比較，各相應時間點相均無明顯差異（P>0.05）。不同處理組小鼠MSCs細胞超微結(jié)構(gòu)：對照組

7、和實驗組A均未見到肺泡Ⅱ型上皮細胞特異性標記物板層小體；實驗組B，可見較多細胞胞漿內(nèi)有板層小體。 結(jié)論：本實驗室成功建立體外非接觸共培養(yǎng)誘導小鼠MSCs分化為肺泡上皮細胞的實驗模型，并證實損傷的肺組織可以促進小鼠MSCs誘導分化為肺泡Ⅱ型上皮細胞（AECⅡ）。 第三章、角化細胞生長因子對骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導分化的影響 目的：觀察角化細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）對

8、體外小鼠MSCs向肺泡上皮細胞誘導分化的影響。 方法：同第二章。共設(shè)計三組：對照組：小鼠MSCs單獨靜置培養(yǎng)+KGF（10μl/ml）；實驗組A：正常肺組織單細胞懸液+MSCs+KGF（10μl/ml）；實驗組B：損傷肺組織單細胞懸液+MSCs+KGF（10μl/ml）。觀察指標也同第二章。 結(jié)果：小鼠MSCs的細胞生長情況：鏡下觀察共同培養(yǎng)8天細胞情況：對照組：細胞增殖良好，大多數(shù)為長梭形細胞；實驗組A：可見約40～5

9、0%的細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切渭毎粚嶒灲MB，大約70～80%的細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切渭毎毎识鄬又丿B生長，細胞之間界限模糊。細胞計數(shù)顯示實驗組B各培養(yǎng)時間點，比實驗組A和對照組的細胞數(shù)目明顯增多（P<0.05）；但實驗組A與對照組相比較無明顯差異（P>0.05）。不同處理組小鼠MSCs細胞超微結(jié)構(gòu)：透射電鏡觀察，對照組和實驗組A的共培養(yǎng)下室中均未見到肺泡Ⅱ型上皮細胞特異性標記物板層小體；而實驗組B細胞胞漿內(nèi)見有較多板層小體。于共培養(yǎng)第8天觀察各

10、處理組小鼠MSCs、SP-C和AQP5的免疫熒光表達：對照組和實驗組A都只檢測到hoechst33342標記的MSCs的藍色熒光，AQP5的紅色熒光，而未見到綠色的SP-C的熒光；但在實驗組B，則可同時檢測到hoechst33342標記的MSCs的藍色熒光，AQP5的紅色熒光，以及綠色的SP-C的熒光。RT-PCR檢測MSCs中SP-C和AQP5 mRNA表達情況：于1、5、8天檢測各處理組的AQP5和SP-CmRNA的表達情況，對照組

11、在共培養(yǎng)開始第1天，可檢測到AQP5的mRNA表達，但AQP5的表達比較弱，不同時間段差異不明顯，而在不同時間段SP-C都沒有表達。 結(jié)論：在與損傷肺組織共同培養(yǎng)體系中，角化細胞生長因子（KGF）可以促進小鼠MSCs向肺泡Ⅱ型上皮細胞（AECⅡ）誘導分化。 第四章、地塞米松對骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導分化的影響 目的：觀察地塞米松（Dexamethasone）對體外小鼠MSCs向肺泡上皮細胞誘導分化的影響。

12、 方法：實驗方法同第二章，觀察指標也同第二章。實驗分組：共分6組，每組6孔。于下列共培養(yǎng)體系中，細胞培養(yǎng)液所加入的Dex的濃度為10-8mol/L，KGF濃度為10ul/ml。對照組A：MSCs+Dex，實驗組A：正常肺組織單細胞懸液+MSCs+Dex，實驗組B：損傷肺組織單細胞懸液+MSCs+Dex，對照組B：MSCs+Dex+KGF，實驗組C：正常肺組織單細胞懸液+MSCs+Dex+KGF，實驗組D：損傷肺組織單細胞懸液+MSCs+

13、Dex+KGF。 結(jié)果：小鼠MSCs的細胞生長情況：小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）培養(yǎng)系統(tǒng)中，在細胞培養(yǎng)液中同時加Dex和KGF，培養(yǎng)8天，比單獨加入Dex細胞增值情況好，多角形細胞比較多（P<0.05）。而損傷的肺組織單細胞懸液共培養(yǎng)系統(tǒng)比其它處理組細胞增值更加良好，有更多的多角形細胞（P<0.05）。不同處理組小鼠MSCs細胞超微結(jié)構(gòu)：小鼠MSCs+Dex培養(yǎng)系統(tǒng)，加入正常肺組織，以及小鼠MSCs+KGF+Dex培養(yǎng)系統(tǒng)，

14、加入正常肺組織，均未見到有肺泡Ⅱ型上皮細胞板層小體表達。但在這兩個共培養(yǎng)系統(tǒng)中加入損傷肺組織懸液時，小鼠MSCs+Dex培養(yǎng)系統(tǒng)的共培養(yǎng)下室可見少部分細胞胞漿內(nèi)見到板層小體。而小鼠MSCs+KGF+Dex培養(yǎng)系統(tǒng)下室中，則見到較多的細胞胞漿中有肺泡Ⅱ型上皮細胞板層小體。于共培養(yǎng)第8天，觀察不同處理組小鼠MSCs中的SP-C、AQP5的免疫熒光表達：對照組A和實驗組A都只檢測到hoechst33342標記的MSCs的藍色熒光，AQP5的紅

15、色熒光，而未見到綠色的SP-C的熒光；而在實驗組B，則可同時檢測到hoechst33342標記的MSCs的藍色熒光，AQP5的紅色熒光，以及綠色的SP-C的熒光。比細胞培養(yǎng)液中未加入Dex，表達熒光的細胞稍減少。在培養(yǎng)液中同時加入Dex和KGF，對照組B和實驗組C都只檢測到hoechst33342標記的MSCs的藍色熒光，AQP5的紅色熒光，而未見到綠色的SP-C的熒光；培養(yǎng)體系中表達熒光的細胞相應比單獨加Dex增多。實驗組D，則可同時

16、檢測到hoechst33342標記的MSCs的藍色熒光，AQP5的紅色熒光，以及綠色的SP-C的熒光。培養(yǎng)體系中表達熒光的細胞相應比單獨加Dex明顯增多。RT-PCR檢測MSCs中SP-C和AQP5 mRNA表達情況：在細胞培養(yǎng)液中未加入Dex，于培養(yǎng)1、5、8天檢測各處理組的AQP5和SP-C mRNA的表達情況，對照組A和實驗組A可檢測到AQP5的mRNA表達，而在不同時間段SP-C都沒有表達。實驗組B在共培養(yǎng)的各時間段可同時檢測到

17、AQP5和SP-C mRNA的表達。在培養(yǎng)液中同時加入Dex和KGF，于培養(yǎng)1、5、8天檢測各處理組的AQP5和SP-C mRNA的表達情況，對照組B和實驗組C可檢測到AQP5的mRNA表達，沒有SP-C mRNA的表達。實驗組D在共培養(yǎng)的各時間段可同時檢測到AQP5和SP-C mRNA的表達。 結(jié)論：本實驗的研究表明：在損傷的肺組織微環(huán)境中，地塞米松（Dex）單獨或與角化細胞生長因子（KGF）共同作用時，都可以促使共培養(yǎng)體系中