骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化.pdf

1、近年來甲狀腺腫瘤發(fā)病率明顯上升，甲狀腺全切或次全切手術(shù)易導(dǎo)致術(shù)后甲狀腺功能減退癥。如何避免這類永久性甲狀腺功能減低患者長期服用甲狀腺激素替代治療，成為亟待解決的問題。近年來干細(xì)胞治療成果顯著，且部分研究成果已經(jīng)在臨床試驗(yàn)中得到很好的應(yīng)用，這為治療甲狀腺疾病提供了全新思路。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有取材方便、體外增殖能力強(qiáng)、可自體回輸從而避免了免疫排斥反應(yīng)等特點(diǎn)，是再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景較為廣泛的種子細(xì)胞。體外研究表明，BM

2、SCs具有多向分化潛能，在特定的誘導(dǎo)條件下可向內(nèi)胚層、中胚層、外胚層三個(gè)胚層的細(xì)胞分化。
　　本實(shí)驗(yàn)利用不同培養(yǎng)條件體外誘導(dǎo)SD大鼠BMSCs分化成甲狀腺濾泡細(xì)胞，探討其對BMSCs向甲狀腺濾泡細(xì)胞方向分化的誘導(dǎo)作用，為干細(xì)胞源性甲狀腺濾泡細(xì)胞誘導(dǎo)分化研究提供新的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，并為探索影響B(tài)MSCs向甲狀腺濾泡細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在誘導(dǎo)分化的基礎(chǔ)上，將BMSCs源性甲狀腺細(xì)胞種植到三維支架材料中，初步探討體外構(gòu)建甲狀腺組織

3、的可行性，以期后期通過移植手段植入大鼠甲狀腺功能減退模型中，檢測其對甲狀腺功能減退癥的可能療效。
　　方法:
　　(1)SD大鼠BMSCs分離、純化、培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀檢測P3代BMSCs表面標(biāo)記物CD44、CD90及CD34的表達(dá)情況，并檢驗(yàn)其成骨分化及成脂分化能力。
　　(2)FRTL-5（Fisher Rat Thyroid Cell Line，大鼠甲狀腺細(xì)胞系）凍存、復(fù)蘇及培養(yǎng)，細(xì)胞免疫熒光法鑒定轉(zhuǎn)錄因子TTFI

4、、PAX8及甲狀腺特有蛋白質(zhì)NIS、TPO、Tg的表達(dá)。
　　(3)按不同培養(yǎng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組。
　　C+F組（共培養(yǎng)+誘導(dǎo)因素組）:將BMSCs與FRTL-5通過transwells小室進(jìn)行間接接觸共培養(yǎng)，添加含誘導(dǎo)因子TSH、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、生長抑素及氫化可的松的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基;C組（共培養(yǎng)組）:將BMSCs與FRTL-5通過transwells小室進(jìn)行間接接觸共培養(yǎng)，添加不含誘導(dǎo)因子的培養(yǎng)基;F組（誘導(dǎo)因子組）:將B

5、MSCs直接暴露于含誘導(dǎo)因子TSH、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、生長抑素及氫化可的松的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基;陰性對照組:BMSCs;陽性對照組:FRTL-5。
　　(4)觀察各實(shí)驗(yàn)組BMSCs向甲狀腺細(xì)胞的分化情況:倒置顯微鏡下觀察共培+誘導(dǎo)因素組、共培組及誘導(dǎo)因素組誘導(dǎo)一周后細(xì)胞形態(tài)的變化;細(xì)胞免疫染色分子層面檢測甲狀腺特有標(biāo)記物的表達(dá)情況;RT-PCR分析從基因水平檢測誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)甲狀腺細(xì)胞相關(guān)基因水平;電化學(xué)發(fā)光法鑒定誘導(dǎo)后細(xì)胞分泌功能。<

6、br>　　(5)用誘導(dǎo)后所得BMSCs源性甲狀腺濾泡細(xì)胞作為種子細(xì)胞，接種于膠原海綿三維支架材料，探索適宜誘導(dǎo)后細(xì)胞生長的實(shí)驗(yàn)條件。
　　結(jié)果:
　　1、SD大鼠BMSCs(P3)誘導(dǎo)后一周，有如下發(fā)現(xiàn):
　　(1)免疫熒光分析顯示各實(shí)驗(yàn)組TTF1、PAX8、NIS、TPO、Tg表達(dá)情況不同，其中以共培養(yǎng)+誘導(dǎo)因子組表達(dá)效果較顯著;
　　(2) RT-PCR分析各實(shí)驗(yàn)組檢測到不同水平的TTF1、PAX8、TSHR

7、、NIS、Tg、TPO基因，其中以共培養(yǎng)+誘導(dǎo)因子組Tg基因水平最佳;(3)經(jīng)電化學(xué)發(fā)光法檢測，發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組可檢測到的T3、T4水平不同，以共培養(yǎng)+誘導(dǎo)因子組為優(yōu)。
　　2、將該共培養(yǎng)+誘導(dǎo)因子組細(xì)胞移植入膠原海綿支架，發(fā)現(xiàn)膠原海綿有利于該細(xì)胞生長，其接種密度為106個(gè)/ml時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間以十天為宜。
　　結(jié)論:在體外BMSCs與FRTL-5間接接觸共培養(yǎng)體系中添加TSH、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、生長抑素及氫化可的松等誘導(dǎo)因子，更有