山羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向生殖細(xì)胞體外轉(zhuǎn)分化的初步研究.pdf

1、生殖細(xì)胞是遺傳物質(zhì)的傳遞者，人類和家畜優(yōu)良性狀的遺傳都要通過生殖細(xì)胞來實現(xiàn)，因此生殖細(xì)胞的發(fā)生也就成為當(dāng)前生殖生物學(xué)研究的熱點之一。然而迄今為止，對生殖細(xì)胞發(fā)育和分化的了解還知之甚少，而干細(xì)胞為研究生殖細(xì)胞的發(fā)育提供了極為有利的工具。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一群存在于骨髓中具有不斷增殖和自我更新能力的成體干細(xì)胞，已在多個物種證明該類干細(xì)胞具有體外分化為3個胚層諸多細(xì)胞類型的

2、能力，可見BMSCs在分化潛能上幾乎可以與ES細(xì)胞相媲美。但與ES細(xì)胞相比，BMSCs具有取材方便、體外易培養(yǎng)、增殖快和免疫原性低等優(yōu)點，是生殖細(xì)胞發(fā)育分化和基因表達(dá)調(diào)控的理想種子細(xì)胞之一。因此，本試驗以體外分離培養(yǎng)的山羊BMSCs作為細(xì)胞模型，研究不同的外源因子（視黃酸RA和骨形態(tài)蛋白BMP4）和內(nèi)源因子（DAZL基因）誘導(dǎo)BMSCs向早期生殖細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，為研究哺乳動物生殖細(xì)胞的發(fā)生及機理建立可靠的模型。
　　本研究共分為三

3、個部分，第一部分為RA和BMP4體外誘導(dǎo)山羊BMSCs向早期生殖細(xì)胞分化;第二部分為過表達(dá)DAZL基因體外誘導(dǎo)山羊BMSCs向早期生殖細(xì)胞分化;第三部分為山羊早期生殖細(xì)胞報告載體pVASA-GFP的構(gòu)建。主要的試驗結(jié)果如下:
　　1.通過不同濃度的RA(0.01，0.1，0.5，1，5，10，50uM)和BMP4(0.01，0.1，1，5，25，50，and100 ng/ml)處理山羊BMSCs，通過兩個生殖細(xì)胞特異性基因MVH和

4、DAZL的表達(dá)來確定最佳RA和BMP4的濃度。結(jié)果顯示，當(dāng)BMP4達(dá)到25 ng/ml時，MVH和DAZL在mRNA水平明顯上調(diào);當(dāng)RA的濃度達(dá)到1μM時，MVH和DAZL在mRNA水平顯著升高。因此確定BMP4和RA的最優(yōu)濃度分別為25ng/ml和1μM。
　　然后，分別用1μM RA，25ng/m BMP4和1μM RA+25ng/mlBMP4三個處理組誘導(dǎo)山羊BMSCs。誘導(dǎo)前后形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示:RA和RA+BMP4組大部分細(xì)

5、胞由梭形變?yōu)閳A形，且圓形細(xì)胞的核質(zhì)比升高，但BMP4組的細(xì)胞沒有呈現(xiàn)明顯的變化。RT-PCR結(jié)果顯示，三組均能誘導(dǎo)表達(dá)MVH、DAZL、C-KIT、NANOG、STELLA和OCT4，但是只有RA和RA+BMP4組能夠表達(dá)STRA8、SCP3、PIWIL2和RNF17。本試驗利用BMP4和RA成功誘導(dǎo)山羊BMSCs向生殖細(xì)胞發(fā)生了轉(zhuǎn)分化，表達(dá)了生殖細(xì)胞特異性相關(guān)標(biāo)記，為后續(xù)向減數(shù)分裂后期生殖細(xì)胞分化奠定了基礎(chǔ)。
　　2.通過傳統(tǒng)的

6、質(zhì)粒方法和體外mRNA合成的方法來過表達(dá)DAZL基因，誘導(dǎo)山羊BMSCs向生殖細(xì)胞分化。將RA處理的細(xì)胞作為對照，比較外源因子和內(nèi)源因子的轉(zhuǎn)分化的效率。結(jié)果表明:DAZL mRNA的表達(dá)水平均顯著上升，MVH mRNA的表達(dá)水平均有上調(diào)，但是mRNA的誘導(dǎo)方法使MVH mRNA水平顯著上升;SCP3表達(dá)也有升高但是差異不顯著。為驗證結(jié)果，我們進一步通過免疫熒光技術(shù)檢測了蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果也表明DAZL和MVH的蛋白水平均有上調(diào)，但通過

7、熒光強度發(fā)現(xiàn)mRNA的方法較有效。
　　此外，為進一步闡明DAZL在山羊BMSCs體外向生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中的作用，本試驗對RA處理的山羊BMSCs進行DAZL基因干擾試驗，結(jié)果顯示:所構(gòu)建的4個干擾載體均能明顯下調(diào)DAZL和MVHmRNA水平的表達(dá)，SCP3的mRNA水平在SH2和SH3干擾后明顯降低，NANOG的mRNA水平在SH2和SH4干擾后明顯升高。免疫熒光結(jié)果分析表明，DAZL和MVH在蛋白水平均呈現(xiàn)明顯下調(diào)。本試驗說