慢病毒載體介導(dǎo)的TNF-α基因在臍血間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、摘要慢病毒載體介導(dǎo)的T N F - Q 基因在臍血間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究摘 要[ 目的] ：構(gòu)建帶有人T N F - Q 基因的慢病毒載體，并觀察該基因在人臍血間質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)。[ 方法] ：通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)從P C D D N A —T N F _ Q 質(zhì)粒中獲得人T N F —Q 基因，利用I n f u s i o n 技術(shù)重組構(gòu)建慢病毒載體穿梭質(zhì)粒p G C —F U —T N F -Q ，在脂質(zhì)體l i p o

2、 f e c t a m i n e2 0 0 0 介導(dǎo)下與結(jié)構(gòu)質(zhì)粒p H e l p e r l ．0 和包膜質(zhì)粒p H e l p e r 2 ．0 共轉(zhuǎn)染2 9 3 T 細(xì)胞包裝生產(chǎn)慢病毒。將人臍血間質(zhì)干細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組( p G C —F U —T N F —Q ) ，空載體對(duì)照組( p G C —F U —E G F P ) 及空白組( U C B M S C s ) ，分別用重組慢病毒，空載慢病毒，P B S 感染后，采用R

3、T —P C R 以及E 1 i s a 檢測(cè)T N F - Q 表達(dá)情況。[ 結(jié)果] ：( 1 ) 所獲T N F —Q 基因測(cè)序證明與G e n e B a n k 中序列一致；( 2 )重組慢病毒載體質(zhì)粒p G C —F U - T N F —Q 經(jīng)鑒定正確； ( 3 ) 三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染2 9 3 T 細(xì)胞成功，收集、濃縮病毒后測(cè)定其滴度為2 ×10 7 T U ／L 。 ( 4 )重組慢病毒感染人臍血間質(zhì)干細(xì)胞后行R T

4、 —P C R 檢測(cè)三組細(xì)胞電泳結(jié)果顯示均有T N F _ Q m R N A 表達(dá)，其中實(shí)驗(yàn)組光密度值( 2 ．7 1 ±1 ．5 7 ) ，與空載對(duì)照組( 4 ．6 3 ±1 ．3 2 ) ，空白組( 6 ．0 3 ±O ．8 8 ) 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( F = I 1 ．6 7 7 ，P < 0 ．0 1 ) ；E L I S A 檢測(cè)三組細(xì)胞T N F - Q 濃度結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組( 1 ．

5、3 2 _ + 0 ．2 3u g ／m 1 ) 與空載對(duì)照組( O ．7 0 ±O ．2 5 u g ／m 1 ) ，空白組( 0 ．7 6 ±0 ．1 1n g ／m 1 ) 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( F = 2 1 ．3 2 1 ，P < 0 ．0 1 ) 。E x p e r i m e n t a l s t u d y o nc o n s t r u c t i o no f l e n t i v

6、 i r a lv e c t o r c a r r y i n g t h eT N F - a g e n e a n d i t s e x p r e s s i o ni nt h e U C B M S C sA b s t r a c tA I M ：T oc o n s t r u c tal e n t i v i r a l v e c t o r c a r r y i n gh u m a nT N F 一0

7、【g e n e ，a n do b s e r v ei t se x p r e s s i o ni nt h eh u m a n u m b i l i c a lc o r d b l o o dm e s e n c h y m a l s t e mc e l l s ．M e t h o d s ：t h eh u m a n T N F 一0 【g e n ew a so b t a i n e dw i t hr

8、e v e r s e t r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( R T —P C R ) f r o mt h eP C DD N A ．T N F 一0 【p l a s m i d ，t h e T N F 一0 【g e n e w a s r e c o m b i n e d t o c o n s t r u c t t h

9、 e t r a n s f e r p l a s m i dp G C _ F U —T N F 。0 【b y i n f u s i o nt e c h n i q u e ，t h et r a n s f e rp l a s m i dp G C ．F U ．T N F 一0 【，t h ec o n s t r u c t i o np l a s m i dH e l p e r l ．0a n d t h ee n

10、 v e l o p ep l a s m i d H e l p e r 2 ．0w e r ec o n t r a n s f e c t e d t o 2 9 3 T c e l l s m e d i a t e db yl i p o f e c t a m i n e2 0 0 0t o p r o d u c el e n t i v i r a lp a r t i c l e s ．t h eh u m a n u

11、 m b i l i c a lc o r db l o o dm e s e n c h y m a l s t e m c e l l sw e r ed i v i d e di n t ot h e p G C —F U - T N F 一0 【g r o u p ( e x p e r i m e n t a lg r o u p ，E G ) ，t h ep G C - F U - E G F Pg r o u p ( m

12、o c kg r o u p ，M G ) a n dt h e u c b m s c sg r o u p ( b l a n kg r o u p ，B G ) w e r e S e p a r a t e l y i n f e c t e d b y o b t a i n e d l e n t i v i r a l p a r t i c l e s ，L e n t i v i r a l p a r t i c l

13、 e s a n d P B S ，t h e e x p r e s s i o n o f T N F ．僅w a s o b s e r v e d b yR T - P C R a n d E l i s a ．R e s u l t ：T h er e s u l t o fs e q u e n c i n gs h o w e dt h a tt h ec l o n e dT N F 一僅g e n ew a sc o