人β-NGF基因載體的構(gòu)建及其在兔骨髓間充質(zhì)干細胞中的表達.pdf

1、鄭碩士論文題目：作者姓名：學科門類：專業(yè)名稱：導師姓名、職稱：學位授予單位代碼學號或申請?zhí)柮芗壧靡徽撐娜薆—NGF基因載體的構(gòu)建及其在兔骨髓間充質(zhì)干細胞中的表達范波勝醫(yī)學神經(jīng)生理學章茜教授邢瑩教授二oo五年五月二十B盞一鄭州丈學2005毀歡士研究，#畢業(yè)論文(摘要)人BNGF基因載體的構(gòu)建段其在兔骨鰱問充質(zhì)干細胞中的表達真核表達載體并實現(xiàn)其在兔BMSCs中表達。方法1從人血白細胞中提取人基因組DNA，設計合適引物，采用PCR技術，擴增出

2、人BNGF前體基因并與pMDl8載體連接，經(jīng)篩選得到重組質(zhì)粒pMDl8BNGF，雙酶切及測序進行鑒定。2將質(zhì)粒pMDl8p—NGF用BamHI、＆oRV酶進行雙酶切，獲得人13一NGF基因片段，將其插入相同酶切的真核表達載體pcDNA30，構(gòu)建基因重組真核表達載體pcDNA30p—NGF，雙酶切對重組載體鑒定。3采集和培養(yǎng)兔BMSCs：應用密度梯度離心法分離兔骨髓中的單個核細胞(mononuclealcells，MNCs)，以1106c

3、ells／ml細胞接種于50ml的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃，體積分數(shù)為5％C02，飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。4采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術，將己構(gòu)建的pcDNA30BNGF質(zhì)粒導入體外培養(yǎng)的兔BMSCs中，加入G418進行篩選，獲得陽性細胞克隆，進行擴增培養(yǎng)。5分別應用RTPCR方法檢測人0NGFfiIJ體基因的mRNA和ELISA方法對人BNGF蛋白進行檢測。結(jié)果1經(jīng)酶切電泳和DNA測序證實，PCR擴出的片段確為人6NGF蒔體基因序列(約726bp)。2

4、成功構(gòu)建重組真核表達載體pcDNA3013一NGF質(zhì)粒。3采集和培養(yǎng)的兔BMSCs生長良好并穩(wěn)定傳代。4轉(zhuǎn)染后經(jīng)G418篩選得到抗性細胞克隆并進行培養(yǎng)。5在轉(zhuǎn)染入pcDNA30—0一NGF質(zhì)粒的兔BMSCs中，應用RTPCR可檢測到人B。NGF前體基凼的mRNA，在其培養(yǎng)上清中應用ELISA方法可檢測到人NGF蛋白。結(jié)論1成功克隆人日NGFfiF體基岡全長序列并成功構(gòu)建重組真核表達載體pcDNA30一B—NGF質(zhì)粒。2人B—NGF基因在