CGRP在人骨髓間充質(zhì)干細胞增殖中的作用研究.pdf

1、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是一種在骨組織中廣泛分布的神經(jīng)肽，已發(fā)現(xiàn)，CGRP與骨組織的增殖、塑形密切相關(guān)。通過組織學研究，在骨折愈合試驗中觀察到，骨組織中，含CGRP的神經(jīng)纖維主要分布在骨生成和塑形活躍的區(qū)域，例如在長骨的干骺端分布就比骨干部位高約10倍，且神經(jīng)分布及CGRP含量的變化與骨折痊愈的過程緊密相關(guān)。研究證實，CGRP能顯著促進成骨細胞增殖，增強成骨活性。 骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)是成骨細胞重要的來源干細胞，也是

2、骨組織工程的主要種子細胞來源。MSCs的增值能力，直接影響骨的生長、塑形和修復，也對組織工程骨的構(gòu)建效能和成骨能力起著決定性的作用。因此，對影響MSCs增殖的因素的研究，一直是骨科界和組織工程學界研究的重點。 目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，MSCs在骨組織的分布，主要集中在干骺端的紅骨髓中，這與CGRP能的神經(jīng)分布相符合，相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，CGRP能促進骨髓有核細胞集落的形成。但是關(guān)于CGRP對MSCs的增殖的影響及其機制，仍有大量研究需要

3、深入。 第一部分：人骨髓間充質(zhì)干細胞表面CGRP受體存在證據(jù) 目的：尋找人骨髓MSCs表面存在CGRP受體的確切證據(jù)(從基因及蛋白質(zhì)表達水平)。 方法：原材料采自健康志愿者骨髓，應(yīng)用梯度離心法及貼壁培養(yǎng)篩選，獲得MSCs細胞。體外培養(yǎng)擴增后，取對數(shù)生長期細胞，采用RT-PCR技術(shù)進行細胞CGRP受體mRNA表達檢測；采用雜交瘤技術(shù)，獲得兔抗人CGRP受體蛋白抗體，利用該抗體，使用Westernblot技術(shù)進行MS

4、Cs表達CGRP受體蛋白檢測。 結(jié)果：采用梯度離心及貼壁培養(yǎng)篩選，細胞純度較高，表面標記穩(wěn)定，且與文獻報道相符；經(jīng)RT-PCR檢測結(jié)果，證實人骨髓MSCs表達CGRP受體mRNA；采用雜交瘤技術(shù)獲得的兔抗人CGRP受體抗體，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，滴度較高，能較好的滿足Westernblot試驗需要；采用Westernblot的DAB顯色法，檢測出人MSCs表達CGRP受體蛋白，且表達量較大。 結(jié)論：采用梯度離心及貼壁培養(yǎng)法獲得MSC

5、s純度較高，增殖效果穩(wěn)定；經(jīng)過RT-PCR檢測，證實MSCs表達CGRP受體mRNA:Western-blot檢測證實，MSCs表達CGRP受體蛋白。 第二部分：CGRP對人骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的作用 目的：觀察在添加外源性CGRP的情況下，MSCs增殖的改變，并證實這種改變與添加CGRP間的關(guān)聯(lián)性。 方法：MSCs獲取仍采自健康志愿者骨髓，應(yīng)用梯度離心法及貼壁培養(yǎng)篩選，獲得MSCs細胞。分組采用對照組、CGRP

6、組(根據(jù)CGRP添加的終濃度分為10-7mol/L、10-8mol/L和10-9mol/L三組)，以MTT法檢測細胞增殖曲線變化；體外培養(yǎng)擴增后，取相同時相點，光鏡下進行細胞形態(tài)觀察；將各組細胞在第三代傳代后72小時的對數(shù)生長期，進行細胞周期檢測，觀察各組細胞處在DNA合成期及細胞分裂前期的比例。 結(jié)果：經(jīng)過對照培養(yǎng)，細胞增殖同時相點，對照組細胞細胞密度低于各實驗組，細胞形態(tài)各組均較為典型、規(guī)則；細胞周期檢測，各實驗組處于細胞分

7、裂前期及DNA合成期細胞比例明顯高于對照組，各實驗組間該比例為，10-8mol/L＞10-9mol/L組＞10-7mol/L，但各實驗組間差異無統(tǒng)計學意義；MTT組檢測，在對數(shù)生長期，各實驗組增殖速率高于對照組，實驗組間細胞增殖速率為10-8mol/L＞10-9mol/L組＞10-7mol/L。10-8mol/L速率與另外兩實驗組間差異有統(tǒng)計學意義，其余兩組間無顯著性差異 結(jié)論：采用MTT法，證實添加外源性CGRP能促進對數(shù)增殖

8、期MSCs細胞增殖速度；采用流失細胞法檢測，證實，外源性CGRP能提高MSCs細胞處于DNA合成和有絲分裂前期的比例。 第三部分：CGRP對人骨髓間充質(zhì)干細胞細胞信號傳導的變化的影響的研究 目的：觀察在添加外源性CGRP的情況下，MSCs胞間通訊連接的改變，并驗證改變與CGRP的關(guān)聯(lián)性。 方法：MSCs獲取仍采白健康志愿者骨髓，應(yīng)用梯度離心法及貼壁培養(yǎng)篩選，獲得MSCs細胞。分組采用對照組、CGRP組和拮抗劑組，

9、放射免疫法檢測各組胞間信號分子cAMP含量改變；使用CFDA染料，應(yīng)用激光共聚焦技術(shù)觀察細胞間縫隙連接和胞間信號傳導能力變化；采用熒光定量PCR技術(shù)檢測縫隙連接分子Cx43mRNA表達變化。 結(jié)果：放免法檢測結(jié)果顯示，各組間，以CGRP組胞間cAMP含量最高，與其余兩組間存在統(tǒng)計學差異；CGRP結(jié)合拮抗劑組的含量高于對照組，后兩者間無統(tǒng)計學差異。采用激光共聚焦技術(shù)，結(jié)合CFDA生物活性染料，顯示CGRP組熒光信號恢復幅度較對照組

10、及拮抗劑組大，差異有顯著性(P＜0.05)；拮抗劑組恢復幅度較對照組大，但兩組間差異不具有顯著性(P＞0.05)。三組細胞Cx43mRNA表達，CGRP組表達量高于抑制劑組及對照組，差異有顯著性(P＜0.05)；抑制劑組表達量高于對照組，兩者間差異無顯著性。 結(jié)論：CGRP能促進MSCs胞間縫隙連接，促進縫隙連接蛋白的基因表達。 第四部分：CGRP對人骨髓間充質(zhì)干細胞細胞增殖相關(guān)因子的作用 目的：研究在添加外源性

11、CGRP的情況下，與MSCs增殖及分化相關(guān)的細胞因子IGF-1、BMP-2的受體mRNA表達變化；研究外源性CGRP是否造成MSCs對成骨誘導因子BMP-2的mRNA表達。 方法：MSCs獲取、分離及培養(yǎng)方法同前。實驗分組為對照組、CGRP組和拮抗劑組，采用熒光定量PCR技術(shù)分別檢測增殖相關(guān)因子IGF-1及其受體mRNA表達；以及成骨分化因子BMP-2及其受體mRNA表達。 結(jié)果：采用相對定量技術(shù)，CGRP組MSCs表達