人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞OCT4的表達(dá)特點(diǎn).pdf

1、目的：分離培養(yǎng)人原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, hMSC)并通過多能性和表型進(jìn)行鑒定，應(yīng)用分子生物學(xué)方法證明hMSC有無功能性表達(dá)OCT4。
　　 方法：利用Ficoll液分離出骨髓單個(gè)核細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)72h后換液，去除未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)80％時(shí)應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)。取第3代hMSC進(jìn)行成脂、成骨分化誘導(dǎo)，然后相應(yīng)的給予油紅O染色和堿性磷酸酶染色，同時(shí)

2、用流式(flow cytometry, FCM)分析細(xì)胞表型，以對hMSC進(jìn)行鑒定。提取hMSC第1、3、5代細(xì)胞總RNA和總蛋白，以人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells, hESCs)H9為陽性對照，分別經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡(western blot, WB)檢測細(xì)胞OCT4的表

3、達(dá)情況。
　　 結(jié)果：成功分離培養(yǎng)出原代hMSC;成脂、成骨誘導(dǎo)分化及相應(yīng)的組織化學(xué)染色細(xì)胞內(nèi)分別可見脂肪滴和藍(lán)色顆粒狀物質(zhì)；流式分析細(xì)胞表面標(biāo)記物：均一表達(dá)CD44、CD73，陽性率均達(dá)95％以上，而不表達(dá)造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志CD14、CD34、CD45、CD31： RT-PCR表明細(xì)胞在mRNA水平上表達(dá)OCT-4,但WB雜交證實(shí)細(xì)胞在蛋白水平上不表達(dá)OCT-4。
　　 結(jié)論：成功分離擴(kuò)增hMSC，擴(kuò)增的細(xì)胞純度很