乙醇改變骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)肽的表達(dá).pdf

1、現(xiàn)如今,患有酒精性股骨頭壞死疾病的患者人群越來越多,嚴(yán)重困擾了人們的生活,但其致病的機(jī)理尚未清楚,而且到目前為止,還未找到任何一種能夠有效預(yù)防酒精性股骨頭壞死的方法。其嚴(yán)重影響了人們的身心健康,降低了生活質(zhì)量。股骨頭缺血壞死是指股骨頭的血運(yùn)不良最終導(dǎo)致骨細(xì)胞及組織的不斷死亡和修復(fù),從而使股骨頭內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,而后塌陷,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)活動(dòng)功能發(fā)生障礙。自17世紀(jì)有學(xué)者提出此病至今,許多學(xué)者先后提出了一系列學(xué)說,但還沒有能夠完整合理說明發(fā)病

2、機(jī)制的學(xué)說。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類能夠向成骨細(xì)胞方向以及其它細(xì)胞方向分化的干細(xì)胞,骨髓中存在一類神經(jīng)肽類物質(zhì),這類物質(zhì)對(duì)成骨或血管的分化有誘導(dǎo)作用,從而參與到骨組織細(xì)胞的代謝過程中,并發(fā)揮著重要的作用。到目前為止,乙醇對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中神經(jīng)肽表達(dá)影響,這方面在國(guó)內(nèi)外還沒有報(bào)道。
　　 目的:
　　 利用體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn),觀察乙醇對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞降鈣素基因相關(guān)肽受體、P物質(zhì)受體、過氧化物酶體增殖子活化受體γmRNA及

3、Runx2mRNA表達(dá)的影響,進(jìn)一步探討酒精性股骨頭缺血壞死的發(fā)病機(jī)制。
　　 材料與方法:
　　 在招募的10名年齡平均在57.5(54-62)歲的健康志愿者中抽取骨髓標(biāo)本,其中有6名男性志愿者,4名女性。
　　 利用密度梯度離心與貼壁分離相結(jié)合的方法分離純化細(xì)胞,使用無菌注射器抽取10 mL髂骨骨髓后,快速注入裝有肝素鈉的無菌管內(nèi)并搖勻,取等體積的Ficoll淋巴細(xì)胞分離液,將標(biāo)本緩慢鋪上,離心后中間的白膜層

4、則是BMSCs細(xì)胞層,輕輕將其抽出,加入PBS混勻,離心后棄去上清,加入培養(yǎng)基,分裝到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng),第3 d后首次換液,根據(jù)培養(yǎng)液的顏色及細(xì)胞生長(zhǎng)情況2d-3d換液,定期觀察細(xì)胞。利用胰酶消化傳代,免疫化學(xué)染色鑒定原代細(xì)胞。取6孔培養(yǎng)板若干,將2代細(xì)胞傳代接種到板上培養(yǎng),當(dāng)孔內(nèi)的細(xì)胞鋪滿板孔80％左右時(shí),通過每4個(gè)樣本一組將細(xì)胞隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組。培養(yǎng)基加入乙醇維持濃度在0.09 mol/L為實(shí)驗(yàn)組,正常培養(yǎng)的則是對(duì)

5、照組。通過Trizol法在使用乙醇干預(yù)的第11d提取RNA,并且檢驗(yàn)RNA純度和完整性。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,而后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)以及PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳,主要觀察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞CGRP受體、P物質(zhì)受體、PPAR-γ,、Runx2 mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果與結(jié)論:
　　 培養(yǎng)11d后,實(shí)驗(yàn)組降鈣素基因相關(guān)肽受體、P物質(zhì)受體、Runx2 mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯降低(P<0.01),過氧