抑制Rac1表達對骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)樣細胞分化的影響研究.pdf

1、目的：探討抑制Rac1的表達對于骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymalstem cells，BMSCs)向神經(jīng)樣細胞分化過程中的影響，為研究BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程中Rael的作用奠定基礎(chǔ)，有助于闡明BMSCs的成神經(jīng)誘導(dǎo)分化機理，為BMSCs在臨床再生醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法：本實驗分三個階段研究抑制Racl表達對BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化的影響。(1)采用Percoll分離法在體外培養(yǎng)

2、及擴增BMSCs。通過免疫熒光染色的方法檢測BMSCs的表面抗原以及將BMSCs進行體外成骨誘導(dǎo)，對BMSCs進行鑒定。(2)采用抗氧化劑誘導(dǎo)方案誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化，即先用濃度為10 n咖l的bFGF預(yù)誘導(dǎo)24h，加入濃度為200 p．M丁羥基茴香醚誘導(dǎo)(BHA)和2％的二甲基亞砜(DMSO)誘導(dǎo)5 h，再用H-DMEM培養(yǎng)基和N2維持48 h。觀察誘導(dǎo)中的形態(tài)變化，用免疫熒光檢測神經(jīng)細胞特異性標(biāo)志物的表達。(3)通過免疫熒

3、光染色檢測BMSCs在成神經(jīng)誘導(dǎo)過程中的：Rac1的表達情況。設(shè)計并合成三對Rael特異性miRNA干擾序列，并將其定向克隆至干擾載體pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR上，提取質(zhì)粒送公司測序。再將重組質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染BMSCs。通過Western blotting檢測三對序列的干擾效果。使用BHA誘導(dǎo)方案將轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的BMSCs向神經(jīng)樣細胞誘導(dǎo)，研究抑制Racl表達對于BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程中形態(tài)學(xué)變化及神經(jīng)細胞

4、特異性標(biāo)志物的表達情況等方面的影響。 結(jié)果：(1)采用Percoll淋巴細胞分離液及不連續(xù)密度梯度法，成功分離培養(yǎng)出大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，可穩(wěn)定傳至20代以上。表型鑒定結(jié)果為CD90、CDl06、CD71、CD29陽性，CD45陰性。誘導(dǎo)BMSCs向成骨細胞分化28 d時，ALP和won kossa染色均為陽性。(2)用bFGF/BHA誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化，誘導(dǎo)過程中細胞形態(tài)學(xué)發(fā)生了改變，胞體變圓，折光率增加，并伸出有

5、2到3或更多突起。誘導(dǎo)初期表達神經(jīng)前體細胞的標(biāo)志物Nestin，陽性率為66.52％±0.8％，95％的細胞表達β-Ⅲ-Tubulin，隨著維持時間的延長，約有29.5％的細胞表達神經(jīng)特異性烯醇化酶NSE。GFAP在誘導(dǎo)過程中始終為陰性。(3)BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化過程中，Rac1始終表達。重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示質(zhì)粒中包含的含有序列與設(shè)計的序列完全一致。將包含干擾序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BMSCs中，轉(zhuǎn)染率達到62.6％。Western