人骨髓間充質(zhì)干細胞向肝樣細胞分化的體內(nèi)外實驗研究.pdf

1、目前國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用多種不同的肝細胞再生的策略誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細胞分化為肝樣細胞。包括應(yīng)用動物胚胎模型、免疫缺陷動物模型、藥物誘導(dǎo)肝損傷模型、肝部分切除術(shù)模型、膽管結(jié)扎以及受者全身照射等方法。本實驗擬①分離和純化人骨髓間充質(zhì)干細胞，檢測其生物學(xué)特性。②以HGF和FGF-4作為誘導(dǎo)分化劑，在體外誘導(dǎo)人源性骨髓間充質(zhì)干細胞向肝樣細胞分化，檢測肝特異性產(chǎn)物的表達。③應(yīng)用肝大部分切除術(shù)以及受者全身照射的方法建立F344大鼠的肝損傷模型，植入人源性

2、骨髓間充質(zhì)干細胞，觀察其對F344大鼠肝功能的影響；檢測F344大鼠肝臟中人ALB的表達情況；檢測各組中人特性基因序列和大鼠特異性基因序列的表達情況。本實驗為解決目前HBAL肝細胞來源匱乏的問題提供一條可行性思路。 第一章人骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性 目的：在體外建立一種簡便可行的人骨髓間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)擴增方法，并就人骨髓間充質(zhì)干細胞的表型、細胞周期、生長曲線、超微結(jié)構(gòu)、核型等方面進行初步分析。

3、 方法：應(yīng)用密度梯度離心法分離人骨髓間充質(zhì)干細胞，條件培養(yǎng)基培養(yǎng)。相差顯微鏡下觀察HMSCs形態(tài)；流式細胞儀檢測HMSCs的表面標記以及細胞周期；繪制HMSCs的生長曲線，計算細胞倍增時間；掃描電鏡和透射電鏡觀察HMSCs的超微結(jié)構(gòu)；Giemsa染色檢測HMSCs的細胞核型。 結(jié)果：密度梯度離心法能分離出純度較高的HMSCs。典型的HMSCs貼壁生長，以長梭形為主，體積小，核漿比大，呈明顯的同向性改變，漩渦狀盤旋排列。細胞存活率

4、均大于95％。流式細胞儀檢測HMSCsCD29陽性表達細胞比率為95.3％，CD34陽性細胞比率為1.8％，CD44陽性細胞比率為94.7％，CD45陽性細胞比率為0.8％，CD71陽性細胞比率為96.2％，CD105陽性細胞比率為96.6％，CD166陽性細胞比率為92.7％，HLA-ABC陽性細胞比率為96.3％，HLA-DR陽性細胞比率為1.1％，UEA-1陽性細胞比率為98.7％。HMSCs的生長曲線呈S形，細胞倍增時間隨代次增

5、加而延長；在傳代7代之前具有較好的生長特性，7代以后的增殖速度開始下降。細胞周期分析顯示，HMSCs具有一定的自我增值能力，其第三代和第六代的S+G2+M期的細胞分別為17.1％和22.8％，大部分細胞仍是處于靜止狀態(tài)。超微結(jié)構(gòu)顯示HMSCs表面較多突起，孔隙較多，胞質(zhì)豐富，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達，囊腔擴張，可見大量蛋白分泌物，也說明HMSCs具有較強的增殖能力。核型分析顯示第3、6代HMSCs的染色體數(shù)量和形態(tài)均未發(fā)生變化，但長期培養(yǎng)的效果還

6、需進一步觀察。 結(jié)論：1.應(yīng)用密度梯度離心法可得到純度較高的HMSCs，能表達人類間充質(zhì)干細胞的表型特征。2.HMSCs能在體外較長期培養(yǎng)。在7代之前細胞增殖旺盛，之后細胞增殖能力逐漸下降。3.在6代之前HMSCs細胞染色體數(shù)目未發(fā)生改變。第二章人骨髓間充質(zhì)干細胞體外分化為肝樣細胞的實驗研究 目的：在成功分離并培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細胞的基礎(chǔ)上，用HGF、FGF-4以及HGF+FGF-4誘導(dǎo)其向肝細胞方向分化，并采用不同方法

7、鑒定細胞分化能力，試圖為HBAL及肝細胞移植等尋找新的種子細胞來源。 方法：應(yīng)用HGF、FGF-4、HGF+FGF-4誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細胞分化為肝樣細胞。實驗分組：A組：未加任何誘導(dǎo)因素的HMSCs；B組：HGF(20ng/ml)，誘導(dǎo)分化HMSCs；C組：FGF-4(10ng/ml)，誘導(dǎo)分化HMSCs；D組：HGF(20ng/ml)+FGF-4(10ng/ml)，誘導(dǎo)分化HMSCs；E組(陽性對照組)：L-02人肝細胞株。

8、相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化；在誘導(dǎo)第7、21d行免疫細胞化學(xué)染色檢測肝細胞標志AFP和CK18，并應(yīng)用圖像分析的方法計算人骨髓間充質(zhì)干細胞的分化比率；在誘導(dǎo)后14d行免疫熒光細胞化學(xué)染色法檢測肝細胞標志物AFP、ALB的表達情況；在誘導(dǎo)后第14和21d取材行RT-PCR檢測，觀察AFP和ALBmRNA表達的情況。 結(jié)果：在加入各種誘導(dǎo)成分后，梭形或成纖維細胞樣細胞隨著誘導(dǎo)時間的延長，變成紡錘形、不規(guī)則圓形或多角形細胞，數(shù)量逐

9、漸變多，與L-02肝細胞形態(tài)相似。在誘導(dǎo)分化第7d和21d免疫細胞化學(xué)染色各誘導(dǎo)組均可檢測出AFP和CK18表達，圖像分析表明HGF+FGF-4聯(lián)合誘導(dǎo)分化的AFP、CK18陽性率最高，HGF次之，F(xiàn)GF-4則較弱；在誘導(dǎo)分化后第14d免疫熒光細胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)各誘導(dǎo)組AFP、ALB均為陽性表達，而陰性對照組則為陰性表達；在誘導(dǎo)分化后第14d和第21dRT-PCR各誘導(dǎo)組均可檢測出AFP和ALBmRNA的表達，而陰性對照組則沒有表達。

10、 結(jié)論：1.人骨髓間充質(zhì)干細胞具有向肝樣細胞分化的潛能。2.HGF、FGF-4、HGF+FGF-4均能誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細胞分化為肝樣細胞，分化后的肝樣細胞能分泌肝細胞特異性產(chǎn)物AFP、ALB、CK18等。3.HGF、FGF-4、HGF+FGF-4誘導(dǎo)HMSCs分化為肝樣細胞的能力不同，以HGF+FGF-4聯(lián)合誘導(dǎo)分化HMSCs的陽性率最高，HGF次之，F(xiàn)GF-4則較弱。 第三章人骨髓間充質(zhì)干細胞在大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)化為肝樣細胞的實

11、驗研究 目的：建立肝臟損傷的模型，建立肝細胞再生的微壞境，將人骨髓間充質(zhì)干細胞植入大鼠肝臟內(nèi)，誘導(dǎo)人骨髓干細胞分化為肝樣細胞，以期在大鼠體內(nèi)獲得足夠數(shù)量的人肝樣細胞，為臨床上生物人工肝和肝細胞移植提供一條思路。 方法：實驗分組：PH組：單純行80％肝葉切除術(shù)而未移植人間充質(zhì)干細胞。PH+BMT組：行80％肝葉切除術(shù)同時移植人間充質(zhì)干細胞。IR組：單純行全身照射而未移植人間充質(zhì)干細胞。IR+BMT組：行全身照射同時移植人間

12、充質(zhì)干細胞。PH+IR組：行80％肝葉切除術(shù)同時行全身照射。PH+IR+BMT組：行80％肝葉切除術(shù)和全身照射同時移植人間充質(zhì)干細胞。應(yīng)用80％肝葉切除術(shù)、受者全身射線照射以及二者聯(lián)合應(yīng)用作為刺激F344大鼠肝再生的模型，在造模后自門靜脈植入人骨髓間充質(zhì)干細胞，設(shè)立對照組，造模后不同時間點采集血樣標本，檢測大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素和凝血酶原時間的變化；在造模后7d、1m和2m取材進行免疫組織化學(xué)染色，檢測大鼠肝臟中人ALB的表達情況，應(yīng)

13、用圖像分析的方法計算出大鼠肝臟中人源性細胞的比例；應(yīng)用PCR技術(shù)檢測大鼠肝臟內(nèi)人特異性DNA序列。 結(jié)果：所有大鼠在造模后均表現(xiàn)反應(yīng)遲鈍，活動減少，毛發(fā)蓬亂。PH、IR和PH+IR組大鼠在造模3d內(nèi)進行性惡化，7d后逐漸好轉(zhuǎn)，28d后與正常大鼠無異。PH+BMT、IR+BMT和PH+IR+BMT組大鼠在造模后12h之后即逐漸好轉(zhuǎn)。造模后行干細胞移植組大鼠肝功能均有明顯改善，與未行干細胞移植組比較差異均有顯著性意義。免疫組織化學(xué)染

14、色在行干細胞移植組中均能檢測到人ALB陽性著色細胞，而未行細胞移植組則為陰性。應(yīng)用圖像分析發(fā)現(xiàn)各干細胞移植組人源性細胞替代率分別為21.20％，23.36％和29.76％，三種肝損傷模型中替代率由高到低分別為PH+IR+BMT、PH+BMT、IR+BMT，以PH+IR+BMT效果最佳。聚合酶鏈反應(yīng)顯示各干細胞移植組大鼠肝臟中均能同時檢測人特異性DNA序列Alu-sx和大鼠特異性DNA序列Soxll，而正常大鼠肝臟只能檢測出Sox11序列

15、，正常人肝臟只能檢測出Alu-sx序列。 結(jié)論：1.人骨髓間充質(zhì)干細胞能在肝損傷大鼠肝臟內(nèi)存活，并能表達人特異性抗原。2.人骨髓間充質(zhì)干細胞能在肝損傷大鼠肝臟內(nèi)能分化為具有肝功能的肝樣細胞，有助于肝損傷大鼠肝功能恢復(fù)，其中以PH+IR+BMT效果最佳。3.人骨髓間充質(zhì)干細胞在肝損傷大鼠肝臟內(nèi)替代比率約為20～30％。4.三種肝損傷模型中替代率由高到低分別為PH+IR+BMT、PH+BMT、IR+BMT，以PH+IR+BMT效果最