hHGF促進人骨髓間充質(zhì)干細胞向肝樣細胞分化的實驗研究.pdf

1、我國有9300萬的乙型肝炎病毒攜帶者，其中2 千萬人為乙肝患者，酒精性肝病及非酒精性肝病的發(fā)病率亦逐年升高，眾多慢性肝臟損傷因素導致纖維結(jié)締組織異常增生，引起肝功能失代償、肝腹水、肝癌、上消化道出血等一系列嚴重并發(fā)癥，藥物難以醫(yī)治，肝移植是目前治療終末期肝病最為有效的方法，但困于肝源缺乏等問題，極大的限制了其臨床應用，骨髓間充質(zhì)干細胞因其無限增殖及多向分化的潛能，有望成為治療終末期肝病的又一可行方法，并已成為研究熱點。
　　 源

2、于中胚層的骨髓間充質(zhì)干細胞具有極強的可塑造性，多項研究表明，其可分化為三個胚層的細胞，如成骨細胞、心肌細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肝細胞等。在急慢性肝病中，移植骨髓間充質(zhì)干細胞進行臨床治療已經(jīng)在多篇文獻中報道，且有多項實驗已在動物體內(nèi)或體外誘導過程中加入各種生長因子，以達到提高干細胞移植療效的目的，目前尚缺乏轉(zhuǎn)染基因后的骨髓間充質(zhì)干細胞在體外誘導成肝樣細胞的實驗研究。
　　 有研究表明肝細胞生長因子（HGF）為骨髓間充質(zhì)干細胞向肝

3、細胞分化最重要的始動因子之一[8]，HGF作用的發(fā)揮同細胞膜受體c-met的結(jié)合密不可分。HGF蛋白與其受體c-Met 結(jié)合后導致c-Met β鏈的酪氨酸 Tyr-1234及 Tyr-1235 殘基自身磷酸化，由此激活了受體內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，導致細胞分裂或分化增加、運動能力增強、細胞間連接消失，從而發(fā)揮其生物學作用[19]。
　　 目的：
　　 本研究應用貼壁培養(yǎng)法，培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞，應用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將HGF基

4、因轉(zhuǎn)染入人骨髓間充質(zhì)干細胞，通過G418 篩選出轉(zhuǎn)染成功的細胞群后擴增出轉(zhuǎn)染成功的細胞克隆，分別應用激光共聚焦、RT-PCR、Western Blot對比轉(zhuǎn)染前后細胞中HGF的表達，此后，運用酒精性肝硬化病人血清對轉(zhuǎn)染前后的細胞進行誘導分化，7D及14D后分別檢測轉(zhuǎn)染前后的各個細胞組中AFP、ALB表達水平，探討轉(zhuǎn)染人促肝細胞生長因子（hHGF）對人骨髓間充質(zhì)干細胞（hBMSCs）向肝樣細胞分化的影響。
　　 方法：
　　

5、 1．克隆hHGF基因，構(gòu)建攜帶hHGF基因的真核表達質(zhì)粒（pcDNA3.1(+)-hHGF），首先應用PCR法獲得HGF cDNA，再次應用限制性內(nèi)切酶將HGF cDNA及pcDNA3.1(+)切成粘性末端，T4 連接酶連接，構(gòu)建重組載體。
　　 2．貼壁培養(yǎng)法擴增人骨髓間充質(zhì)干細胞，每日倒置顯微鏡觀察細胞生長狀況，隔日換液，獲得了一些貼壁培養(yǎng)細胞的體會與經(jīng)驗，擴增后選擇生長狀態(tài)良好的細胞進行基因轉(zhuǎn)染。
　　 3．用

6、脂質(zhì)體將pcDNA3.1(+)-hHGF 轉(zhuǎn)染人骨髓間充質(zhì)干細胞，G418 篩選轉(zhuǎn)染后的陽性克隆，分別通過激光共聚焦、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）、免疫蛋白印跡(Western blot）檢測hBMSCs中表達hHGF的水平；
　　 4．用酒精性肝硬化患者血清誘導hBMSCs，采用Western blot分別檢測各組細胞內(nèi)甲胎蛋白（AFP）及白蛋白（ALB）的表達變化。
　　 結(jié)果：
　　 1．瓊脂糖電泳提

7、示，擴增的目的基因hHGF的cDNA為2200bp，成功將此cDNA與帶有粘性末端的質(zhì)粒定向連接，構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定及測序鑒定，hHGF基因讀碼框架完全正確；
　　 2．細胞培養(yǎng)傳代成功，細胞生長良好，呈梭形及魚群樣生長，獲取較多生長狀態(tài)良好的人骨髓間充質(zhì)干細胞；
　　 3．通過脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒成功的導入了人骨髓間充質(zhì)干細胞，經(jīng)過G418 篩選，激光共聚焦、RT-PCR、Western blot 結(jié)果均證實經(jīng)轉(zhuǎn)染h

8、HGF基因后的人骨髓間充質(zhì)干細胞中hHGF分子呈高表達；
　　 4．人骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)過誘導后逐漸變?yōu)樯掀ぜ毎麡蛹毎?，形態(tài)呈三角形或不規(guī)則形，未經(jīng)誘導組細胞變化不明顯，Western blot 結(jié)果表明誘導7D，14D 轉(zhuǎn)染hHGF基因后的人骨髓間充質(zhì)干細胞中AFP、ALB表達明顯高于其他實驗組。
　　 結(jié)論：
　　 1．擴增了hHGF cDNA 全長序列，且成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-hHGF；<

9、br>　　 2．貼壁培養(yǎng)法可培養(yǎng)出人骨髓間充質(zhì)干細胞，并在體外進行大量擴增，細胞狀態(tài)良好；
　　 3．重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-hHGF 可通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，hHGF基因在轉(zhuǎn)染的細胞內(nèi)可以成功表達目的蛋白；
　　 4．人骨髓間充質(zhì)干細胞經(jīng)酒精性肝硬化血清誘導后可向肝樣細胞分化，hHGF基因轉(zhuǎn)染后的細胞向肝樣細胞分化的能力增高，表明hHGF基因在細胞內(nèi)成功表達后可以提高人骨髓間充質(zhì)干細胞向肝樣細胞分化的能力。