非黏附骨髓間充質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞的實驗研究.pdf

1、本文將在此理論基礎上通過反復轉(zhuǎn)移的非黏附細胞培養(yǎng)法分離小鼠骨髓中的非黏附間充質(zhì)干細胞；觀察表皮生長因子對非黏附間充質(zhì)干細胞克隆形成效率的調(diào)節(jié)作用；并深入探討非黏附骨髓間充質(zhì)干細胞在體外、體內(nèi)尤其是缺血損傷的微環(huán)境中分化為神經(jīng)細胞的潛能，為這些細胞進一步用于細胞移植治療相關(guān)疾病提供技術(shù)參數(shù)。 第一部分:小鼠非黏附骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)、鑒定以及表皮生長因子對其克隆形成效率的影響 目的：分離培養(yǎng)并鑒定小鼠骨髓中的非黏附間

2、充質(zhì)干細胞( Non-adhaerent Bone-Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells，NA-BM-MSC)；觀察表皮生長因子(Epidermal Growth Factor，EGF)對NA-BM-MSC產(chǎn)生成纖維細胞集落形成單位(colony-formingunits-fibroblast，CFU-F)效率的影響。 方法：分離小鼠總骨髓細胞，分兩組體外培養(yǎng)，一組在總骨髓細胞中加入10ng

3、/mL的EGF，另一組為對照組，每天轉(zhuǎn)移未貼壁的非黏附骨髓細胞(Non-adherent Bone Marrow Cells,NA-BMC)到新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，每組中各皿細胞長滿12天后，亞甲基藍染色顯示形成的克隆，計數(shù)克隆個數(shù)；在總骨髓細胞培養(yǎng)到第四天時收集未貼壁的NA-BMC到新的培養(yǎng)血中，待細胞貼壁生長達融合后傳代純化，取第四代細胞接種于向脂肪細胞、軟骨細胞和成骨細胞誘導分化的培養(yǎng)液中，2周后分別進行油紅染色、抗Ⅱ型膠原的免疫

4、組織化學染色以及茜素紅染色檢測脂肪滴、Ⅱ型膠原和鈣化結(jié)節(jié)的形成和表達情況；流式細胞檢測表面標記物的表達。 結(jié)論：小鼠骨髓細胞培養(yǎng)過程中，24小時內(nèi)未貼壁的NA-BMC轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)能夠重新貼壁并形成CFU-F，并且NA-BMC所形成的克隆具有向脂肪細胞、軟骨細胞和成骨細胞分化的能力，具備了干細胞自我復制更新和多分化潛能的兩大特性，并表達間充質(zhì)細胞的特異性標記物，因此稱其為非黏附骨髓間充質(zhì)干細胞(NA-BM-MSC)。E

5、GF能有效促進NA-BM-MSC的增殖，進一步提高了該細胞的富集效率。 第二部分:非黏附骨髓間充質(zhì)干細胞體外向神經(jīng)細胞分化的實驗研究 目的：探討骨髓中存在的NA-BM-MSC在體外向神經(jīng)細胞分化的能力。 方法：分離小鼠骨髓總細胞進行培養(yǎng)，于第四天收集未貼壁的NA-BMC到新的培養(yǎng)環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞貼壁融合后傳代純化，取第四代細胞用于誘導實驗；細胞按照1X103/Cm2的密度接種于預置蓋玻片的六孔板中，細胞貼壁

6、后，更換培養(yǎng)液為含20ng/ml的EGF和20ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子-2(b-FGF)的誘導液進行誘導，2周后，甲苯胺藍染色和抗神經(jīng)細胞特異性核蛋白、抗神經(jīng)中間絲蛋白的免疫細胞化學染色檢測神經(jīng)細胞特異性蛋白的表達。 結(jié)論：NA-BM-MSC在適當?shù)臈l件下能夠被誘導分化成神經(jīng)細胞，為下一步用于體內(nèi)實驗的研究提供了保證。 第三部分:非黏附骨髓間充質(zhì)干細胞在缺血損傷腦內(nèi)向神經(jīng)細胞分化的實驗研究 目的：探討骨

7、髓非黏附間充質(zhì)干細胞(non-adherent bone marrow mesenchymal stem cells，NA-BM-MSC)在缺血損傷的腦內(nèi)存活以及向神經(jīng)細胞分化的能力。 方法：從β-Gal轉(zhuǎn)基因小鼠分離總骨髓細胞，培養(yǎng)到第四天時，收集未貼壁的NA-BMC到新的培養(yǎng)環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，貼壁增殖，待生長到融合時傳代純化，取第4代NA-BM-MSC定向移植到小鼠大腦中動脈阻塞腦缺血模型腦內(nèi)，8周后LacZ組織化學染色和免疫

8、組織化學染色法觀察供體細胞在缺血腦內(nèi)微環(huán)境中的存活情況以及神經(jīng)元特異性核蛋白(NeuN)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞特異性酸性蛋白(GFAP)的表達。 結(jié)論：小鼠骨髓內(nèi)的NA-BM-MSC在缺血損傷的腦內(nèi)能夠存活、遷移，部分細胞還能分化為成熟的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞參與腦損傷的修復，為下一步作為種子細胞用于移植修復實驗提供了保證。 本課題的特征和創(chuàng)新之處在于： 通過反復轉(zhuǎn)移的非黏附細胞培養(yǎng)法成功分離出非黏附的骨髓細胞，并通過克隆