腺病毒介導(dǎo)的BDNF基因?qū)顾柚蠦DNF基因表達的影響.pdf

1、目的：隨著交通事業(yè)及工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，周圍神經(jīng)損傷成為臨床上常見疾病。周圍神經(jīng)損傷的顯微外科修復(fù)技術(shù)已經(jīng)十分精湛，卻長期以來難以獲得滿意結(jié)果。隨著分子生物學(xué)和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)不斷進步，神經(jīng)損傷的基因治療研究正在興起。周圍神經(jīng)損傷后再生是一個極為復(fù)雜的生物化學(xué)和細胞學(xué)過程。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）是神經(jīng)營養(yǎng)因子（NTF）的第二成員，是一種主要存在與腦及脊髓中，能夠維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種神經(jīng)元存活及促進神經(jīng)軸突生長的堿性蛋白。但BDNF基因在正

2、常的中樞神經(jīng)中表達量較少。神經(jīng)受損后雖然BDNF表達明顯增多，但表達量不穩(wěn)定，時間短。應(yīng)用復(fù)制缺陷型重組腺病毒（Adenovirus，AdV）為載體導(dǎo)入受損的周圍神經(jīng)各種神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因治療促進其修復(fù)再生具有特異、高效、安全等有點，已成為神經(jīng)修復(fù)研究領(lǐng)域的前沿。本實驗將Wistar大鼠隨即分為三組：正常Wistar大鼠組（A組），對照組（B組），實驗組（C組）。將腺病毒介導(dǎo)的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）（C組）或不攜帶外源基因的Ad

3、0（B組）通過微量注射器導(dǎo)入 Wistar大鼠腰膨大脊髓實質(zhì)內(nèi)，比較轉(zhuǎn)染外源性BDNF后與導(dǎo)入Ad0后BDNF基因在脊髓前角表達的情況，計數(shù)BDNF染色陽性細胞數(shù)，并比較與正常對照組大鼠脊髓中內(nèi)源性BDNF表達的情況；并通過多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測腺病毒在B、C兩組脊髓中的存活時間，采用病毒液10倍系列稀釋提取DNA檢測出腺病毒的特異性條帶的最低稀釋度，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測BDNF基因在大鼠脊髓中的表達情況及表

4、達時間，以探討腺病毒介導(dǎo)的外源性 BDNF基因?qū)顾柚蠦DNF基因表達的影響因素。
　　 方法：選用7周齡健康雌性Wistar大鼠180只，體重200-250g。將大鼠隨機分成三組，每組60只。正常Wistar大鼠組（A組）為正常大鼠，不導(dǎo)入腺病毒及其攜帶的基因；對照組（B組）導(dǎo)入Ad0；實驗組（C組）導(dǎo)入AdBDNF。將實驗對照組及實驗組大鼠經(jīng)腹腔注射氯胺酮/塞拉嗪麻醉（75-100mg/kg+5mg/kg），麻醉成功后固定于

5、腦立體定位儀上。取長約2cm后正中切口，去除T13椎板，暴露脊髓腰膨大部位。利用微量注射器及ST-Ⅲ型手動推進器，于脊髓后正中動脈右側(cè)0.8mm處注射Ad0（5×109pfu/ml）1μl（B組）或AdBDNF（1×109 pfu/ml）1μl（C組）。針尖向頭側(cè)呈45度斜行進針，斜行刺入深度為2.5mm。注射速度為1μl/min，注射完畢后滯針5min，緩慢拔針。充分止血、沖洗傷口，局部噴灑抗生素預(yù)防感染，關(guān)閉傷口。B、C組大鼠轉(zhuǎn)染病

6、毒后2天、4天、7天、2周、3周、4周、5周取材，A組大鼠任意時間取材，標本為大鼠脊髓。對三組大鼠脊髓進行厚40μm的連續(xù)冰凍橫切片經(jīng)行免疫組織化學(xué)染色，計數(shù)三組中不同時間點BDNF在脊髓前角運動神經(jīng)元染色陽性的細胞數(shù)，分析比較三組BDNF基因在脊髓表達的高峰期和持續(xù)時間。PCR及RT-PCR實驗標本取B、C兩組2天、4天、7天、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周大鼠脊髓標本及A組任意時間脊髓標本。將三組脊髓標本搗成

7、勻漿，多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）監(jiān)測B、C兩組病毒注入脊髓的存活時間，采用病毒液10倍系列稀釋提取DNA檢測腺病毒的靈敏度；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測三組組BDNF基因在大鼠脊髓中表達的情況。
　　 結(jié)果：
　　 1 BDNF轉(zhuǎn)基因表達：BDNF染色陽性細胞多存在脊髓雙側(cè)的前角運動神經(jīng)元和周圍的膠質(zhì)細胞。表達范圍局限于注射點上下各0.5cm區(qū)段，轉(zhuǎn)基因表達的陽性冰凍橫切片數(shù)A組冰凍切片數(shù)≤26片，B組冰凍切

8、片數(shù)≤60片，C組陽性細胞冰凍切片數(shù)≤103片。轉(zhuǎn)基因神經(jīng)元在注射同側(cè)表達明顯較對側(cè)強烈。切片觀察可見A組內(nèi)源性BDNF陽性細胞主要分布與脊髓灰質(zhì)前角神經(jīng)元，分布較均勻；B組的BDNF染色陽性表達時間約為5周；C組的BDNF染色陽性表達時間約為5周。脊髓陽性細胞計數(shù)顯示B組BDNF在脊髓表達較A組強烈，高峰期為轉(zhuǎn)染Ad0后在1周，以后逐漸下降，但至五周后仍高于A組水平；C組BDNF在脊髓中的表達較A、B兩組顯著強烈，高峰期為轉(zhuǎn)染AdBD

9、NF后1周，至5周后表達下降但仍高于A，B組水平。統(tǒng)計學(xué)分析表明B、C兩組在高峰期間BDNF陽性細胞數(shù)計數(shù)有顯著差異（P<0.05），B組在高峰期與A組，C組在高峰期與A組的BDNF陽性細胞計數(shù)有顯著差異（P<0.05）。
　　 2 PCR及RT-PCR檢測：
　　 2.1脊髓標本腺病毒PCR的檢測：用PCR法從DNA水平分別檢測腺病毒在實驗對照組、實驗組的脊髓標本中存活時間。腺病毒的DNA量是隨時間延長逐漸下降的，直至

10、第十周檢測不到腺病毒的表達。
　　 2.2 RT-PCR檢測BDNF基因在大鼠脊髓組織的表達：用RT-PCR法從mRNA水平分別檢測正常組，實驗組、對照組中BDNF的表達情況：正常實驗組中可監(jiān)測出一定量的BDNFmRNA，隨時間沒有變化趨勢。轉(zhuǎn)然1天后兩組均可檢測出BDNFmRNA在脊髓組織中表達，對照組表達上調(diào)高峰為術(shù)后7天，高表達量可持續(xù)到第五周，到第八周降至正常組水平。實驗組表達上調(diào)高峰為術(shù)后7天，高表達量可持續(xù)五周，到第

11、十周降至正常組水平。統(tǒng)計學(xué)分析表明B、C兩組之間在表達高峰期間BDNFmRNA表達數(shù)量顯著差異，（P>0.05），兩組組內(nèi)不同時間點比較BDNFmRNA表達量有顯著差異（P<0.05）。
　　 結(jié)論：通過三組大鼠脊髓標本的BDNF免疫組織化學(xué)染色及RT-PCR檢測，可以表明在正常Wistar大鼠脊髓中，BDNF染色陽性細胞主要存在與脊髓前角，分布較均勻。將不介導(dǎo)外源性基因腺病毒Ad0注射入脊髓引起的脊髓機械性（微量注射器刺激）及