含LacZ基因重組腺病毒的制備及其在大鼠脊髓中的表達.pdf

1、目的:神經損傷后的修復仍然是困擾著神經科學基礎與臨床的一道難關。但由于其自身結構及再生特點,僅依靠外科手術修復斷裂神經,其遠期結構和功能恢復,尤其是運動功能的恢復難以獲得滿意的效果。在治療外周神經損傷的各種方法中,基因治療的研究進展尤為受到重視。周圍神經損傷基因治療是指通過某種方法、途徑將目的基因導入人體細胞,使其在體內發(fā)揮作用,以達到基因治療的目的,這不僅包括對中樞神經元的保護作用,還要能促進損傷神經的修復。其中腺病毒載體在神經再生、

2、神經肌肉疾病以及神經示蹤等基因治療的實驗研究方面已經表現(xiàn)出了多方面的優(yōu)勢。腺病毒載體是目前使用最多的病毒載體之一,其常用于表達外源性蛋白,是很好的表達重組抗原的載體系統(tǒng)。其具有宿主范圍廣泛、基因轉移效率高、重組病毒滴度相對較高、外源基因容量較大、所介導的外源性基因的表達水平高以及不會引起宿主細胞基因突變等優(yōu)點,并且其表達的外源蛋白具有天然蛋白的特性。這些特點使腺病毒成為基因治療的重要載體。重組腺病毒載體(Recombinant aden

3、ovirus,AdV)既能感染分裂期細胞,也能感染非分裂期細胞,且攜帶的外源基因可長期存在,穩(wěn)定表達,因此被普遍用于將外源基因導入受體細胞,被認為是神經系統(tǒng)高效的基因轉染載體。正因為其轉染細胞的高效性、多樣性及轉染后的安全性等特點,AdV的應用為基因治療外周神經損傷帶來了希望。我們擬構建含LacZ基因的重組質粒,制備攜帶目的基因LacZ的病毒,并期望能進一步將此載體通過損傷的外周神經傳至脊髓,觀察其在靶神經元的表達及其產物對外周神經的標

4、記進程,掌握轉基因的表達規(guī)律和特點,從而為腺病毒介導神經營養(yǎng)因子治療外周神經損傷提供依據。
　　 方法:
　　 1 將已經包裝好的含有LacZ基因的腺病毒載體質粒在感受態(tài)細胞中擴增,從而得到足夠轉染計量的質粒。收集擴增質粒并于-20℃凍存待用。
　　 2 復蘇HEK-293細胞,在5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。培養(yǎng)時2-3天換液。每天觀察細胞生長,當細胞密度接近50％時傳代,注意早期傳代細胞的凍存。
　　

5、 3 擴增后的質粒使用脂質體2000轉染試劑盒轉染HEK-293細胞,包裝帶有LacZ基因的重組腺病毒,在-70℃和37℃溫度下通過反復凍融提純腺病毒。
　　 4 病毒擴增后在96孔板中感染培養(yǎng)好的HEK-293細胞,在顯微鏡下可觀察到293細胞有明顯的CPE現(xiàn)象,利用50％組織培養(yǎng)感染劑量法測定病毒滴度。
　　 5 將制備好的腺病毒2ul導入大鼠脊髓腰膨大節(jié)段,7天后取材,切成40μm的連續(xù)橫切片,37℃下溫箱內0.1

6、％X-gal染液染色4h,挑選有陽性反應的切片貼片、中性紅復染、封片。
　　 結果:
　　 1 HEK-293細胞呈梭形,多觸角,貼壁強度小,細胞之間通過觸角相互連接,傾向于形成單層細胞。
　　 2 重組腺病毒轉染HEK-293細胞3天后,經4％多聚甲醛液固定20分鐘及0.1％X-gal溶液染色4小時,在光學顯微鏡下觀察細胞藍染情況,即檢測到LacZ基因的表達,細胞表達出攜帶目的基因的腺病毒顆粒,對照組未發(fā)現(xiàn)細胞

7、藍染情況。
　　 3 脊髓橫切片中,LacZ基因陽性表達的藍染細胞多位于脊髓前角,以注射側藍染細胞數量為多。濃密的藍染使陽性細胞的形態(tài)清晰,很容易辨認出這些細胞是脊髓前角運動神經元和周圍的膠質細胞。
　　 結論:
　　 1 保持HEK-293細胞在最適宜生長條件,有助于質粒的轉染及病毒的成功制備。
　　 2 轉染后反復凍融提純病毒,重復感染293細胞,在排除其他感染的情況下細胞死亡,初步證明腺病毒能在細胞