hNGFβ基因重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其在星形膠質(zhì)細(xì)胞和CCI動(dòng)物中的作用研究.pdf

1、第一部分 細(xì)菌內(nèi)同源重組構(gòu)建含hNGFβ基因的腺病毒質(zhì)粒 目的細(xì)菌內(nèi)同源重組制備含hNGFβ基因的重組腺病毒質(zhì)粒，在293細(xì)胞內(nèi)包裝后純化重組腺病毒。方法將hNGFβ外源性核酸片段插入到經(jīng)XmaⅠ與XbaⅠ酶切的pBluescriptⅡsk(+)，構(gòu)建成轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pBluescriptⅡsk(+)-hNGFβ，將其經(jīng)KpnⅠ和NotⅠ雙酶切后，與經(jīng)同樣雙酶切的穿梭質(zhì)粒pShuttle-CMV定向重組，構(gòu)建成穿梭質(zhì)粒pShu

2、ttle-CMV-hNGFβ，將該穿梭質(zhì)粒經(jīng)PmeⅠ酶切后，轉(zhuǎn)化含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的感受態(tài)菌BJ5183，重組為pAdEasy-1-hNGFβ，酶切鑒定正確后，用Lipofect介導(dǎo)轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞，包裝為重組腺病毒Ad-hNGFβ后用PCR鑒定。透析純化后的腺病毒采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行滴度測(cè)定。結(jié)果線性化的pShuttle-CMV-hNGFβ轉(zhuǎn)化含pAdEasy-1的感受態(tài)菌BJ5183，24h后獲得了30％陽(yáng)性重組

3、質(zhì)粒，經(jīng)酶切得到一條大于20kb的大片段和一條4.5kb的特征性條帶，PCR擴(kuò)增出731bp片段。純化后測(cè)得滴度為2.24×1012OPU/L。結(jié)論應(yīng)用細(xì)菌內(nèi)同源重組能快速構(gòu)建含hNGFβ基因的重組腺病毒載體pAdEasy-1-hNGFβ，酶切鑒定，包裝為高滴度的重組腺病毒Ad-hNGFβ，為hNGFβ基因的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。 第二部分 Ad-hNGFβ在原代培養(yǎng)的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)及其生物活性的研究 目的

4、：以體外培養(yǎng)新生SD大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞為靶細(xì)胞，證明其能表達(dá)有生物活性的目的基因產(chǎn)物，觀察前期所重組的Ad-hNGFβ對(duì)靶細(xì)胞的存活及毒性作用，為下一步的在體研究打下基礎(chǔ)。方法：從新生SD大鼠的脊髓組織中分離星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte，Ast)，應(yīng)用DMEM/F-121∶1培養(yǎng)基進(jìn)行原代培養(yǎng)及擴(kuò)增，用膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)免疫熒光法進(jìn)行鑒定。用重組腺病毒Ad-hNGFβ(MOI為100)轉(zhuǎn)染Ast后，用免疫組化法，初步測(cè)

5、定培養(yǎng)3天時(shí)Ad-hNGβ的表達(dá)情況；用ELISA方法測(cè)定培養(yǎng)3d、6d及9d時(shí)，培養(yǎng)上清中NGFβ的含量；用噻唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞OD570值，分析細(xì)胞對(duì)Ad-hNGFβ的敏感性；用流式細(xì)胞儀對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行倍體分析，觀察對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果：從新生SD大鼠的脊髓組織中成功分離培養(yǎng)出星形膠質(zhì)細(xì)胞，GFAP免疫熒光陽(yáng)性。脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞可被Ad-hNGFβ感染并表達(dá)hNGFβ；試驗(yàn)組hNGFβ表達(dá)量與對(duì)照組同期相比，均有顯著

6、差異，P＜0.01；并且隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，hNGFβ表達(dá)量下降，第9天與前兩次比均有顯著差異，P＜0.01。經(jīng)噻唑藍(lán)測(cè)定，試驗(yàn)組MTT的吸光值OD570與對(duì)照組比有顯著差異，P＜0.01。流氏細(xì)胞儀測(cè)得細(xì)胞凋亡與MTT結(jié)果同步。結(jié)論：Ad-hNGFβ能在原代培養(yǎng)的脊髓背角星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，表達(dá)高峰時(shí)間約在第三天。MOI為100時(shí)無(wú)明顯細(xì)胞毒作用，且能夠增加細(xì)胞活性。 第三部分： 鞘內(nèi)注射Ad-hNGFβ對(duì)神經(jīng)痛作

7、用的研究 目的：研究鞘內(nèi)注射Ad-hNGFβ對(duì)CCI大鼠疼痛的影響及機(jī)制。方法：建立CCI動(dòng)物模型后，隨機(jī)分為Ⅰ組：CCI術(shù)后立即L5～L6處鞘內(nèi)注射Ad-hNGFβ；Ⅱ組：CCI術(shù)后立即L5～L6處鞘內(nèi)注射人工腦脊液ACSF；Ⅲ組：假手術(shù)組，除不行坐骨神經(jīng)結(jié)扎外，其它同Ⅱ組。測(cè)定術(shù)前、術(shù)后每4日各組大鼠足底熱痛閾、機(jī)械痛閾值(最終結(jié)果以手術(shù)側(cè)：非手術(shù)側(cè)的比值表示)及行為學(xué)評(píng)分。分別于術(shù)后4天、7天、14天、28各天取8只動(dòng)物麻

8、醉后，4只灌注固定，取L4～L6段脊髓，免疫組化法測(cè)定脊髓背角痛物質(zhì)SP、CGRP的變化；另4只不灌注固定，麻醉后直接斷頭處死，冰上快速取L4～L6脊髓勻漿后ELISA法測(cè)定hNGFβ的含量。結(jié)果：所有CCI動(dòng)物術(shù)后0～28天均出現(xiàn)痛覺過(guò)敏，出現(xiàn)明顯的疼痛行為學(xué)改變和熱痛閾、機(jī)械痛閾的降低。CCI術(shù)后立即鞘內(nèi)注射Ad-hNGFβ動(dòng)物自術(shù)后第4天開始熱痛敏明顯減輕，與同一時(shí)點(diǎn)CCI+ACSF組比，P＜0.05；整體疼痛行為學(xué)有所改善，但無(wú)