大鼠糖皮質(zhì)激素受體基因腺病毒載體的構(gòu)建及其在腎系膜細(xì)胞中的表達.pdf

1、目的：利用AdEasy系統(tǒng)構(gòu)建大鼠糖皮質(zhì)激素受體(GR)基因重組腺病毒載體，轉(zhuǎn)染大鼠系膜細(xì)胞，并通過Western Blot方法檢測GR蛋白的表達． 方法：將質(zhì)粒pcDNA1．Neo-Rat GR擴增、膠回收獲得的Rat GR cDNA雙酶切片段插入腺病毒穿梭載體質(zhì)粒pShuttle-CMV的巨細(xì)胞病毒(cMV)啟動子下游，構(gòu)建重組穿梭載體pShuttle-CMV-Rat GR，線性化后與骨架載體AdEasy-1在細(xì)菌BJ518

2、3內(nèi)經(jīng)同源重組得到腺病毒重組質(zhì)粒pAd-Rat GR，經(jīng)人胚腎293細(xì)胞包裝后得到復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad-Rat GR；用包裝后的病毒上清轉(zhuǎn)染大鼠腎系膜細(xì)胞，提取細(xì)胞中的總蛋白，通過Western Blot方法檢測GR蛋白的表達。 結(jié)果：連接、重組后通過酶切和測序法篩選出pAd-Rat GR重組質(zhì)粒，；經(jīng)人胚腎293細(xì)胞包裝，48小時后觀察到增強型綠色熒光蛋白(EGFP)明顯表達，氯化銫梯度離心純化最終獲得1×10<'9>PF