人Dazl基因重組腺病毒載體的構建.pdf

1、背景與目的
　　生殖健康是當今世界愈來愈受到關注的問題。治療因生殖細胞缺陷所致的男性不育是醫(yī)學的一大難題,干細胞的多能性及體外受精技術為解決該難題提供了技術方法。我們前期的研究證實人臍帶間充質干細胞(Humanumbilicalcordwharton’sjelly-derivedmesenchymalstemcells,HUMSCs)經(jīng)維甲酸誘導能向男性生殖細胞方向分化,但在分化至減數(shù)分裂前期的生殖細胞時存在“分化停滯”,因此尋找

2、其它途徑讓HUMSCs分化為成熟的精子并能用于男性不育的治療是當前急需解決的關鍵技術問題。DeletedinAzoospermia-Like(DAZL)基因是表達生殖細胞特異RNA結合蛋白的基因,是精子發(fā)生的重要調控因子,該基因突變或表達缺乏將導致精子發(fā)生過程減數(shù)分裂障礙和雄性不育。腺病毒(adenovirus,Ad)載體是一類已得到大量研究并有臨床應用報道的載體系統(tǒng)。它具有病毒滴度高、宿主細胞范圍廣、轉染效率高和不會整合人靶細胞基因組

3、等優(yōu)點。據(jù)此,本研究擬采用GatewayTM技術構建高效表達的DAZL重組腺病毒載體系統(tǒng),結合前期對HUMSCs的研究,通過DAZL基因異位表達誘導HUMSCs體外分化為男性生殖細胞提供轉導載體及實驗支持。
　　材料與方法
　　1、依據(jù)Genbank中DAZL序列化學合成全基因序列,應用PCR方法擴增DAZL目的基因,并插入克隆載體pMD18-Tsimplevector中,轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,提取重組質粒獲得了T

4、S-DAZL,酶切鑒定并進行測序分析。
　　2、基因測序正確后,重組質粒TS-DAZL與穿梭載體pIRES2-EGFP,各用XhoI及EcoRI酶兩步法雙酶切后連接,將TS-DAZL基因亞克隆到穿梭載體pIRES2-EGFP中,連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,提取重組質粒獲得了pIRES2-EGFP-DAZL,酶切鑒定并進行測序分析。
　　3、應用BPClonaseII重組酶,與pDONR221進行同源重組反應,獲得

5、入門克隆;應用LRClonaseII重組酶,與pAD/CMV-DEST腺病毒載體進行LR體外同源重組反應,連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞進行擴菌,抽提質粒,獲得pAd-DAZL-EGFP重組質粒。
　　4、重組質粒pAd-DAZL-EGFP經(jīng)PacI酶切線性化后轉染293A細胞進行包裝,獲得重組腺病毒顆粒Ad-EGFP-DAZL。將所得病毒原液反復轉染293A細胞后進行病毒擴增,經(jīng)3-4代大量病毒擴增后收集并純化,最后用免

6、疫法測定病毒滴度。
　　5、Ad-EGFP-DAZL轉染HUMSCs測定腺病毒載體轉染效率,確定最佳感染復數(shù)。
　　實驗結果
　　全基因合成目的基因,各中間載體經(jīng)PCR法,限制性酶切分析,DNA測序證實正確。轉染293A細胞7-10天出現(xiàn)皺縮、變圓、出現(xiàn)空泡、死亡及脫落等細胞病變表現(xiàn),10-13天細胞病變達80％,最終的包裝病毒中攜帶有目的基因,并能夠在包裝細胞中的表達。免疫法測定病毒滴度測得病毒滴度約為1.04*10

7、9puf/ml。Ad-DAZL-GFP轉染HUMSCs,當MOI為100時,超過80%的細胞出現(xiàn)熒光,且不影響靶細胞生長,選擇MOI=100為最佳感染復數(shù)。
　　結論
　　采用GatewayTM技術能有效且較為方便的構建人DAZL基因重組腺病毒載體,重組子能夠在293A細胞中擴增,病毒包裝的成功為進一步研究DAZL體外誘導臍帶間充質干細胞提供了一個良好的轉導載體。在腺病毒載體介導下DAZL基因可高效感染人臍帶間充質干細胞,最